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Modifications de nucléotides libres

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Nous savons que l'ARN peut être modifié après transcription (modification de l'ARN). Ainsi, lorsque l'ARN est dégradé, est-il possible que de telles modifications soient toujours présentes sur les nucléotides individuels - de sorte que lorsque les nucléotides sont recyclés pour construire un autre ARN, ces modifications persistent ?


Nucléotide

Un nucléotide est une molécule organique qui est la pierre angulaire de l'ADN et de l'ARN. Ils ont également des fonctions liées à la signalisation cellulaire, au métabolisme et aux réactions enzymatiques. Un nucléotide est composé de trois parties : un groupe phosphate, un sucre à 5 carbones et une base azotée. Les quatre bases azotées de l'ADN sont l'adénine, la cytosine, la guanine et la thymine. L'ARN contient de l'uracile au lieu de la thymine. Un nucléotide dans une chaîne constitue le matériel génétique de tous les êtres vivants connus. Ils remplissent également un certain nombre de fonctions en dehors du stockage d'informations génétiques, en tant que messagers et molécules énergétiques.

Une série de trois nucléotides dans l'ADN est connue sous le nom de codons, et dirige les protéines dans la cellule pour attacher une protéine spécifique à une série spécifiée par le reste de l'ADN. Des codons spéciaux précisent même à la machine où arrêter et démarrer le processus. Traduction d'ADN, comme on le sait, convertit les informations de l'ADN dans le langage des protéines. Cette chaîne d'acides aminés peut ensuite être correctement repliée et fournir l'une des nombreuses fonctions au sein de la cellule.


Régulation du traitement de l'ARN

Lorsqu'un gène eucaryote est transcrit dans le noyau, le transcrit primaire (molécule d'ARN fraîchement fabriquée) n'est pas encore considéré comme un ARN messager. Au lieu de cela, il s'agit d'une molécule « immature » ​​appelée pré-ARNm.

Le pré-ARNm doit subir certaines modifications pour devenir une molécule d'ARNm mature qui peut quitter le noyau et être traduite. Ceux-ci incluent l'épissage, le coiffage et l'ajout d'une queue poly-A, qui peuvent tous être potentiellement régulés - accélérés, ralentis ou modifiés pour aboutir à un produit différent.

Épissage alternatif

La plupart des molécules de pré-ARNm ont des sections qui sont retirées de la molécule, appelées introns, et des sections qui sont liées ou ensemble pour former l'ARNm final, appelé exons. Ce processus est appelé épissure.

Dans le processus de épissage alternatif, différentes parties d'un ARNm peuvent être sélectionnées pour être utilisées comme exons. Cela permet à l'une ou l'autre de deux (ou plus) molécules d'ARNm d'être fabriquées à partir d'un pré-ARNm.

Figure 1. Image modifiée à partir de “Eukaryotic Post-transcriptional Gene Regulation,” par OpenStax College, Biology (CC BY 3.0).

L'épissage alternatif n'est pas un processus aléatoire. Au lieu de cela, il est généralement contrôlé par des protéines régulatrices. Les protéines se lient à des sites spécifiques sur le pré-ARNm et indiquent les facteurs d'épissage quels exons doivent être utilisés. Différents types de cellules peuvent exprimer différentes protéines régulatrices, de sorte que différentes combinaisons d'exons peuvent être utilisées dans chaque type de cellule, conduisant à la production de différentes protéines.


1.4 : Enzymes modifiant l'ADN

  • Contribution de Michael Blaber
  • Professeur (sciences biomédicales) à la Florida State University

Méthylases

Tout comme l'étude du système de restriction-modification bactérien a fourni une variété d'endonucléases spécifiques, il existe également une variété d'ADN méthylases spécifiques.

  • Les séquences de reconnaissance des méthylases sont les mêmes que les endonucléases associées (par exemple, la méthylase EcoR1 reconnaît et méthyle à la séquence "GAATTC").
  • Toutes les méthylases transfèrent le groupe méthyle de la S-adénosylméthionine (SAM) à une base spécifique dans la séquence de reconnaissance, et la SAM est un composant requis dans la réaction de méthylation.
  • La méthylation de l'ADN a généralement pour effet de protéger l'ADN de l'endonucléase de restriction apparentée. Cependant, il existe des méthylases avec une spécificité minimale. Par exemple, Sss I méthylase méthylera les résidus cytosine dans la séquence 5' &hellip CG &hellip 3'. Dans ce cas, l'ADN méthylé sera protégé d'une grande variété d'endonucléases de restriction.
  • Certaines endonucléases de restriction ne coupent l'ADN au niveau de leurs sites de reconnaissance que si l'ADN est méthylé (par exemple Dpn I).
  • D'autres endonucléases de restriction encore couperont les deux ADN méthylé et non méthylé au niveau de leurs séquences de reconnaissance (par exemple BamH I).

Endiguer et dcm Méthylation

  • La méthylase codée par le endiguer gène (dam méthylase) transfère un groupe méthyle de SAM vers le N6 position de la base adénine dans la séquence 5' &hellip GATC &hellip 3'.
  • La méthylase codée par le dcm gène (dcm méthylase) méthyle la base interne de la cytosine, au C5 position, dans les séquences 5' &hellip CCAGG &hellip 3' et 5' &hellip CCTGG &hellip 3'.
  • Presque toutes les souches de E. coli couramment utilisés dans le clonage ont un endiguer+dcm+ génotype. Le point ici est ne pas que nous voulons particulièrement que notre ADN soit méthylé, mais que pour faire un barrage-dcm- héberger quelqu'un doit muter la bactérie et isoler le bon mutant. Cela n'a apparemment pas été fait pour beaucoup de souches bactériennes. Probablement parce que le endiguer et dcm la méthylation n'affecte qu'un petit sous-ensemble d'endonucléases de restriction potentielles

ADN isolé de barrage+dcm+ souches ne sera pas réellement coupé par un sous-ensemble modeste d'endonucléases de restriction disponibles :

Séquence de reconnaissance Enzyme de restriction GATC G me ATC
TGATCA Bcl je + -
GATC Mbo je + -
ATCGAT Cla I + -
TCTAGA Xba je + -
TCGA Taq I + -
GAAGA Mbo II + -
GGTGA Hph je + -

L'ADN peut devoir être préparé à partir de souches d'E. coli qui sont dam-dcm- afin d'être coupé par ces enzymes.

ADN polymérases

Une grande variété de polymérases a été caractérisée et est disponible dans le commerce. Toutes les ADN polymérases partagent deux caractéristiques générales :

  1. Ils ajoutent des nucléotides au extrémité 3'-OH d'un apprêt
  2. L'ordre des nucléotides dans le polynucléotide naissant est modèle dirigé

Graphique 1.4.1 :Réplication de l'ADN

En plus de l'activité polymérase 5'->3', les polymérases peuvent contenir une activité exonucléase. Cette activité exonucléase peut se dérouler soit dans le sens 5'->3', soit dans le sens 3'->5'.

  • L'activité exonucléase dans la direction 3'->5' permet à la polymérase de corriger une erreur si elle incorpore un nucléotide incorrect (appelé "activité de correction d'erreurs"). Il peut également dégrader lentement l'extrémité 3' de l'amorce.
  • L'activité exonucléase dans la direction 5'->3' lui permettra de dégrader toute autre amorce hybridée qu'elle pourrait rencontrer. Sans activité exonucléase 5'->3', les amorces d'obstruction peuvent ou non être physiquement déplacées, selon la polymérase utilisée.

Différentes polymérases ont différents taux d'erreur de mauvaise incorporation et différents taux de polymérisation.

ADN polymérase I de E. coli E. coli ADN polymérase I - Fragment de Klenow ADN polymérase T4 ADN polymérase T7 Taq ADN polymérase Transcriptase inverse M-MuLV
Activité exonucléase 5'->3' * *
Activité exonucléase 3'->5' * * * *
Taux d'erreur (x10 -6 ) 9 40 <1 15 285
Déplacement de brin *
Inactivation thermique * * * *

Utilisations des polymérases

Les diverses activités des différentes polymérases les prêtent à une variété d'applications. Par exemple, les endonucléases de restriction peuvent produire des fragments d'ADN avec des « surplombs » de nucléotides en 3' ou en 5'.

  • Dans le cas des surplombs 5', l'activité polymérase 5'->3' peut les remplir pour faire extrémités émoussées.
  • Dans le cas de surplombs 3', l'activité d'exonucléase 3'->5' présente dans certaines polymérases (en particulier l'ADN polymérase T4) peut "réduire" ces extrémités pour former également des fragments d'ADN à extrémités franches.

Graphique 1.4.2 :Activité polymérase

"Nick-traduction"

Cette méthode est utilisée pour obtenir des fragments d'ADN simple brin hautement radiomarqués, qui utilise l'activité exonucléase 5'->3' présente dans certaines polymérases (E. coli ADN polymérase I, par exemple).

  • Dans cette méthode, un duplex d'ADN d'intérêt est « coupé » (c'est-à-dire qu'un des brins est coupé, voir DNAse I).
  • Ensuite, l'ADN pol I est ajouté avec des nucléotides radiomarqués. L'activité exonucléase 5'->3' ronge l'extrémité 5' au niveau du site "nick" et l'activité polymérase incorpore les nucléotides radiomarqués. Le polynucléotide résultant sera fortement radiomarqué et s'hybridera à la séquence d'ADN d'intérêt.

Graphique 1.4.3 :Nick-traduction

  • Les polymérases thermostables ont la capacité de rester fonctionnelles dans des plages de températures où le duplex d'ADN "fondra" réellement et se séparera. Cela a permis le développement de la "Réaction en chaîne de la polymérase" technique (PCR), qui a eu un impact profond sur la biotechnologie moderne. Nous discuterons de cette méthode à une date ultérieure.
  • L'incorporation de bases didésoxy (c'est-à-dire aucun groupe hydroxyle sur le carbone 2' ou 3' du sucre ribose) conduit à fin de la réaction de polymérase. Ceci sera discuté plus en détail plus tard. Cependant, cette terminaison de chaîne par incorporation de didésoxynucléotides est à la base de la méthode Sanger de séquençage de l'ADN, ainsi que des thérapies pour tenter d'inhiber la réplication virale.

Nucléases

Nucléase BAL-31

  • C'est un exonucléase (commence aux extrémités et travaille vers l'intérieur) qui dégradera à la fois les extrémités 3' et 5' de l'ADN double brin. Il ne fera pas de clivages internes ("coupures"), cependant, il dégradera les extrémités de l'ADN au niveau des "coupures" internes existantes (qui créent à la fois des extrémités 3' et 5').
  • La dégradation des terminaisons n'est pas coordonnée, ce qui signifie que le produit est ne pas 100 % émoussé (même si le duplex d'origine peut avoir été émoussé).
  • De telles extrémités « quotragées » peuvent être rendues franches en les remplissant et en les mâchant par une polymérase appropriée (par exemple, l'ADN polymérase T4). La définition d'unité de 1 unité est la quantité d'enzyme nécessaire pour éliminer 200 paires de bases de chaque extrémité de l'ADN duplex en 10 minutes à 30 °C.

Graphique 1.4.4 :Activité de la nucléase BAL-31

Exonucléase III

  • Catalyse l'élimination progressive des nucléotides des terminaisons hydroxyle 3' de l'ADN duplex.
  • L'enzyme attaquera l'hydroxyle 3' au niveau de l'ADN duplex avec des extrémités franches, avec des surplombs 5', ou avec des "coupures" internes.
  • Comme l'ADN duplex est nécessaire, l'enzyme Ne fera pas digérer l'extrémité 3' de l'ADN duplex où les extrémités sont des surplombs 3'.

Graphique 1.4.5 :Activité de l'exonucléase III

Nucléase de haricot mungo (isolé de germes de haricot mungo)

  • UNE spécifique à un seul brin Endonucléase d'ADN et d'ARN qui dégradera les extensions simple brin des extrémités de l'ADN et de l'ARN en laissant des extrémités franches.
  • Les extensions simple brin peuvent être des extensions 5' ou 3' - les deux sont supprimées et un duplex émoussé est laissé.

Graphique 1.4.6 :Activité de la nucléase du haricot mungo

Désoxyribonucléase I (ADNase I) de pancréase bovine

  • Cette enzyme hydrolyse les brins d'ADN duplex ou simples préférentiellement au niveau des liaisons phosphodiester 5' à pyrimidine nucléotides
  • En présence d'ions Mg 2+, la DNAse I attaque chaque brin indépendamment et produit des coupures de manière aléatoire (utile pour la traduction des coupures)
  • En présence de l'ion Mn2+, la DNAse I clive les deux brins d'ADN approximativement à la même position (mais en laissant des extrémités "quotragées")

Ligas

  • Les ligas catalysent le formation d'une liaison phosphodiester entre les extrémités juxtaposées 5' phosphate et 3' hydroxyle des nucléotides (potentiellement ARN ou ADN selon la ligase).
  • En un sens, elles sont à l'opposé des endonucléases de restriction, mais elles ne semblent pas être influencées par la séquence locale, en soi.
  • Les ligas exigent soit rATP ou NAD+ comme cofacteur, et cela contraste avec les endonucléases de restriction.

Voici différents types de ligases et leurs caractéristiques.

ADN ligase T4

  • Isolé du bactériophage T4.
  • Ligaturera les extrémités de l'ADN ou de l'ARN duplex.
  • Cette enzyme rejoindra les extrémités franches ainsi que les extrémités avec des extrémités cohésives (complémentaires) en surplomb (soit des surplombs complémentaires 3' ou 5').
  • Cette enzyme réparera également les coupures simple brin dans les duplex d'ADN, d'ARN ou d'ADN/ARN. A besoin ATP comme cofacteur.

Taq ADN ligase

  • Cette ligase va catalyser une liaison phosphodiester entre deux oligonucléotides adjacents qui s'hybrident à un brin d'ADN complémentaire :

Graphique 1.4.7 :Activité Taq ADN ligase

  • La ligature n'est efficace que si les oligonucléotides s'hybrident parfaitement avec le brin matrice.
  • L'enzyme est active à des températures relativement élevées (45 - 65 °C). A besoin NAD+ comme cofacteur.

ARN ligase T4

  • Catalysera la formation d'une liaison phosphodiester entre les oligonucléotides ARN/ARN, les oligonucléotides ARN/ADN ou les oligonucléotides ADN/ADN.
  • A besoin ATP comme cofacteur.
  • Cette enzyme ne nécessite pas de brin matrice.

L'ARN ligase T4 peut être utilisée à diverses fins, y compris la construction de molécules hybrides ARN/ADN.

Graphique 1.4.8 :Activité ARN ligase T4

ADN ligase (E. coli)

  • Catalysera une liaison phosphodiester entre l'ADN duplex contenant des extrémités cohésives.
  • Ce sera ne pas ligaturer efficacement les fragments à extrémités franches.
  • A besoin NAD+ comme cofacteur.

Graphique 1.4.9 :Activité ADN ligase (E. Coli)

T4 polynucléotide kinase

  • Catalyse le transfert et l'échange d'un groupe phosphate de la g position du rATP (nucléotide adénine ribose triphosphate) à l'extrémité 5' hydroxyle de l'ADN ou de l'ARN double brin et simple brin, et nucléoside 3' monophosphates.
  • L'enzyme éliminera également les groupes phosphoryle 3'.
  • Les oligonucléotides obtenus à partir de synthétiseurs automatisés n'ont pas de groupe phosphate 5' et ne peuvent donc pas être ligaturés à d'autres polynucléotides.

La polynucléotide kinase T4 peut être utilisée pour phosphoryler l'extrémité 5' de ces polynucléotides :

Graphique 1.4.10 :Activité polynucléotide kinase T4


Avantages

  • Haute pureté (>99%) selon HPLC (Figure 1)
  • Sans DNase, RNase et inhibiteurs de qPCR, PCR et RT
  • Stable pendant 3 ans à -20 o C
  • Disponible dans des formulations personnalisées et pour un approvisionnement commercial


Les tests de qualité permettent de garantir des performances exceptionnelles des dNTP ou des NTP dans vos expériences de biologie moléculaire. Les évaluations sont faites en utilisant un certain nombre de méthodes analytiques (Tableau 1 Figure 1).

Tableau 1. Paramètres qualitatifs et spécifications

ParamètreEssaisspécification
PhysiqueConcentration100 + 3 mm
ApparenceSolution claire et incolore
PH7.3-7.5
Stabilité à -20 o C36 mois
HPLCdNTP> 99% de pureté
NTP> 99% de pureté
Pyrophosphate< 0,003 pmol PPi/pmol dNTP
FonctionnelDNase, RNase et activité d'entaille Pas détectable
ADN bactérien (qPCR, E.Coli ARNr 23S)Pas détectable
Contamination par l'ADN humain (qPCR, ADNg humain)Pas détectable

Figure 1. Profils HPLC relatifs de dNTP purs à environ 99%. L'analyse HPLC montre une pureté de triphosphate supérieure à 99 % avec des formes mono-, di- et tétraphosphate indétectables.


Produits et commande

[1] Tavernier et al. (2011) ARNm comme gène thérapeutique : Comment contrôler l'expression des protéines. Journal de la maladie contrôlée 150:238.
[2] Kariko et al. (2011) Génération de l'ARNm optimal pour la thérapie : la purification par HPLC élimine l'activation immunitaire et améliore la traduction de l'ARNm codant pour les protéines et modifié par les nucléosides. Nuclei Acids Res. 39 (21):9329.
[3] Pascolo et al. (2006) Vaccination avec l'ARN messager. Dans: Méthodes en médecine moléculaire 127 (Saltzmann). Presse Humana.
[4] Kormann et al. (2011) Expression de protéines thérapeutiques après administration d'ARNm chimiquement modifié chez la souris. Biotechnologie naturelle 29 (2):154.
[5] Kariko et al. (2008) L'incorporation de Pseudouridine dans l'ARNm donne un vecteur non immunogène supérieur avec une capacité de traduction accrue et une stabilité biologique. Mol. Là. 16 (11):1833.
[6] Kariko et al. (2005) Suppression de la reconnaissance de l'ARN par les récepteurs de type Toll : l'impact de la modification nucléosidique et l'origine évolutive de l'ARN. Immunité 23:165.
[7] Anderson et al. (2011) Les modifications nucléosidiques de l'ARN limitent l'activation de la 2'-5'-oligoadénylate synthétase et augmentent la résistance au clivage par la RNAse L. Nuclei Acids Res. 39 (21):9329.
[8] Warren et al. (2011) Reprogrammation hautement efficace vers la pluripotence et la différenciation dirigée des cellules humaines avec un ARNm modifié synthétique. Cellule souche 7:618.
[9] Andy et al. (2015) L'ARNm incorporé à la N (1)-méthylpseudouridine surpasse l'ARNm incorporé à la pseudouridine en fournissant une expression protéique améliorée et une immunogénicité réduite dans les lignées cellulaires de mammifères et les souris. J. Contrôle. Sortie 217:337.
[10] Li et al. (2016) Effets de l'ARN messager modifié chimiquement sur l'expression des protéines Bioconjugué Chem. 27 (3):849.


5. CARTOGRAPHIE DE L'ÉPITRANSCRIPTOME CAP

5.1. m 7 G et Nm dans le capuchon d'ARNm étendu

Bien qu'une grande partie de l'intérêt récent pour l'épitranscriptomique se soit concentré sur les nucléotides modifiés situés sur des sites internes (c'est-à-dire entre le capuchon d'ARNm et la queue poly(A)), le niveau de modification de l'ARN est considérablement plus élevé au niveau du capuchon d'ARNm par rapport aux sites internes. Outre m 6 A, il existe quatre autres modifications méthyles abondantes dans l'ARNm. Ce sont le méthyle N-7 dans le capuchon m 7 G, les deux 2′-O-méthyl modifications qui se trouvent au niveau des premier et deuxième nucléotides matrices, et le N 6 -méthyle qui se trouve avec un 2′-O-méthyle en m 6 Am qui peut être trouvé au niveau du premier nucléotide modélisé. Ensemble, ces marques méthyles comprennent les cinq principales modifications méthyles de l'ARNm.

Pour l'instant, aucune analyse à l'échelle du transcriptome n'a été rapportée pour la modification méthyle dans la coiffe m 7 G ou le 2′-Omodifications -méthyle au niveau des premier et deuxième nucléotides matricés. Néanmoins, il existe des preuves que ces modifications pourraient être réglementées. Dans le cas de m 7 G, l'enzyme qui méthyle la guanosine en NLa 7-méthylguanosine, RNMT, est régulée dans le cancer, et la surexpression de la RNMT favorise le développement du cancer (Cowling 2010a, 2010b). Cela suggère que dans des conditions normales, certains ARNm ne sont pas méthylés efficacement pour former la coiffe m 7 G, et l'expression de RNMT permet à ces ARNm de mûrir pour acquérir une coiffe m 7 G entièrement fonctionnelle. Étant donné que le capuchon m 7 G est nécessaire pour l'exportation nucléaire de l'ARNm (Inesta-Vaquera et Cowling 2017), les ARNm non méthylés coiffés de guanosine peuvent être retenus dans le noyau ou dégradés.

La casquette associée 2′-OLes modifications -méthyles peuvent également être régulées. Il convient de noter que certains ARNm peuvent manquer du 2′-O-modifications méthyle au total. Ces ARNm sont appelés cap 0. D'autres ARNm peuvent n'avoir que le 2′-O-modification méthyle sur le premier nucléotide codé, mais pas sur le second (appelé �p 1”). Ce 2′-O-la modification méthylique est installée par CMTR1, qui nécessite un ARN coiffé de m 7 G comme substrat (Bélanger et al. 2010 Inesta-Vaquera et Cowling 2017). Le CMTR1 est physiquement associé à l'ARN Pol II (Haline-Vaz et al. 2008), ce qui suggère que cette modification peut être introduite de manière cotranscriptionnelle dans l'ARNm.

Les ARNm peuvent également avoir à la fois le premier et le deuxième nucléotide transcrit méthylés au niveau du 2′-hydroxyle, appelé cap 2 (Furuichi et al. 1975). Il est peu probable que les ARNm n'aient que le deuxième nucléotide à matrice 2′-O-méthylé car CMTR2, l'enzyme qui introduit le 2′-O-méthyle sur le deuxième nucléotide montre une activité méthyltransférase accrue vers l'ARNm coiffé avec un 2′-O-méthyle sur le premier nucléotide (Werner et al. 2011).

Une fonction majeure de 2′-O-méthylation est que cette modification peut contribuer à une voie de défense antivirale. L'infection virale est associée à l'induction de CMTR1 qui convertit les ARN cap 0 en ARNm cap 1 et potentiellement cap 2 (Daffis et al. 2010 Züst et al. 2011). La présence de 2′-O-les modifications méthyliques empêchent ces ARNm de se lier aux protéines IFIT, qui sont induites par l'interféron en réponse à une infection virale (Fensterl et Sen 2015). Les IFIT se lient à leurs ARNm cibles au niveau de la structure de la coiffe étendue et suppriment la traduction en se faisant concurrence pour la liaison par les protéines de liaison de la coiffe (Habjan et al. 2013 Kimura et al. 2013). Ainsi, 2′-O-méthylation protège les ARNm de l'hôte de la réponse antivirale, qui est destinée à être dirigée vers les ARN viraux.

Cependant, 2′-O-méthylation est détectée dans les cellules même en l'absence d'infection virale, et les niveaux de cap 1 et cap 2 semblent différer entre les cellules (Furuichi et al. 1975). Ainsi, 2′-O-méthylation au niveau de la coiffe peut avoir des fonctions même en l'absence d'infection virale. Pour l'instant, la distribution de 2′-OLes modifications -méthyl associées aux coiffes d'ARNm n'ont pas été cartographiées dans le transcriptome.

5.2. m 6 h

La seule méthylation associée à la coiffe qui a été profilée à l'échelle du transcriptome est m 6 Am. m 6 Am est cartographié simultanément avec m 6 A dans le protocole m 6 A miCLIP (décrit ci-dessus), qui utilise un anticorps m 6 A. Les anticorps m 6 A se lient également au m 6 Am (Munns et al. 1979) et sont donc plus précisément décrits comme des anticorps 6-méthyladénine pour refléter leur liaison aux deux nucléotides contenant de la 6-méthyladénine, m 6 A et m 6 Am.

Avant le développement de miCLIP, m 6 A et m 6 Am ne pouvaient pas être distingués. Par conséquent, les pics MeRIP-seq trouvés dans l'UTR 5′ n'ont pas pu être facilement attribués à un m 6 A ou à un m 6 Am. En théorie, l'emplacement du pic MeRIP-seq dans l'UTR 5′ pourrait laisser entendre qu'il reflète un m 6 A, plutôt qu'un m 6 Am, qui se trouve exclusivement au niveau du nucléotide de début de transcription. Un pic au milieu de l'UTR 5′ n'est clairement pas au niveau du nucléotide de début de transcription. Malheureusement, ce raisonnement n'est pas valable. De nombreux transcrits ont des sites de démarrage de transcription alternatifs, dont certains peuvent être en aval des sites de démarrage de transcription annotés (Shiraki et al. 2003). Par conséquent, un m 6 Am d'une isoforme avec un 5′ UTR plus court que l'isoforme 5′ UTR annotée produira un pic qui semble être au milieu de l'UTR 5′ annoté malgré le fait qu'il soit situé à le site de début de transcription d'une isoforme d'ARNm différente.

Dans MeRIP-seq, les fragments d'ARN sont immunoprécipités et l'ARN est transcrit en inverse pour former le premier brin d'ADNc. Ensuite, le deuxième brin d'ADNc est fabriqué en coupant l'ARN et en utilisant l'extrémité libre comme amorce pour la synthèse d'ADN. Dans ce protocole, l'extrémité 5 & x02032 de l'ARN n'est pas conservée, car le deuxième brin d'ADNc commence de manière quelque peu aléatoire en fonction de la position de l'entaille.

Dans le cas de m 6 A, le manque de préservation de l'extrémité 5' n'est pas important car m 6 A peut se trouver n'importe où dans l'ARN immunoprécipité. Par conséquent, le m 6 A sera toujours au milieu du pic résultant. Cependant, pour le m 6 Am, les fragments d'ARN seront différents dans chaque cas, le m 6 Am sera toujours exactement à l'extrémité 5 de l'ARN. Par conséquent, la perte de l'extrémité 5′ signifie que le MeRIP-seq sera positionné en aval du site réel du m 6 Am. Le pic ressemblera à un pic m 6 A en aval du site réel du m 6 Am.

miCLIP surmonte ce problème en préservant l'extrémité exacte 5′ des ARN immunoprécipités. Étant donné que toutes les lectures contenant m 6 Am auront la même extrémité 5′ (c'est-à-dire le nucléotide de début de transcription), cela entraînera l'apparition d'un 𠇌liff” ou d'un bord qui délimite clairement la position de m 6 Am. Les méthodes de bibliothèque qui préservent l'extrémité 5′ des ARN réduisent l'ambiguïté de l'attribution d'un pic à m 6 A ou m 6 Am.

Sur la base de la cartographie de m 6 Am à l'aide de miCLIP, une fonction pour m 6 Am a pu être identifiée. Notre analyse a montré que les ARNm contenant m 6 Am présentent des demi-vies d'ARNm plus longues que les ARNm qui commencent par d'autres nucléotides. La stabilité de m 6 Am semble être médiée, au moins en partie, par une sensibilité réduite des ARNm contenant m 6 Am au décapsulage. L'analyse biochimique des ARN contenant m 6 Am a montré qu'ils étaient décoiffés par l'enzyme de décapage Dcp2 avec une efficacité nettement réduite par rapport aux ARN similaires contenant de l'Am. Ainsi, une seule modification méthyle N-6 provoque un décapage réduit de l'ARN. Notamment, les ARNm m 6 Am présentent également une sensibilité réduite aux microARN, qui induisent une étape de décapage dans le cadre de leur mécanisme pour induire la dégradation de l'ARN. Ainsi, m 6 Am peut avoir un rôle dans la stabilisation des ARNm.

À l'heure actuelle, l'enzyme qui forme le m 6 Am à partir de l'Am a été purifiée biochimiquement (Keith et al. 1978) mais pas encore clonée. L'identification de cette enzyme permettra une analyse plus complète de la fonction de cette modification dans l'ARNm. De plus, les “readers” du m 6 Am ne sont pas encore connus, mais ils peuvent contribuer au mécanisme d'amélioration de la traduction médiée par le m 6 Am ou à d'autres effets du m 6 Am.


Modifications des nucléotides libres - Biologie

Un "Ribonucléoside", A "Déoxyribonucléoside", A "Ribonucléotide"

Dérivés nucléotidiques :

De nombreuses réactions biosynthétiques dans le métabolisme des glucides nécessitent des dérivés nucléotidiques.

c'est-à-dire Glucose-1-phosphate + ATP ----> ADP-glucose

Structure des nucléotides

Structure primaire des acides nucléiques :

La séquence ou l'ordre des nucléotides définit la structure primaire de l'ADN et de l'ARN. Les nucléotides du polymère sont liés par des liaisons phosphodiester se connectant par l'oxygène sur le carbone 5' de l'un à l'oxygène sur le carbone 3' de l'autre. Les atomes d'oxygène et d'azote dans le squelette donnent à l'ADN et à l'ARN une "polarité".

Structure secondaire des acides nucléiques :

Une base purique s'apparie toujours avec une base pyrimidine ou plus précisément Guanosine (G) avec la Cytosine (C) et l'Adénine (A) avec la Thymine (T) ou l'Uracil (U).

Notez que la paire G-C a trois liaisons hydrogène tandis que la paire A-T a deux liaisons hydrogène.

ADN: La structure secondaire de l'ADN consiste en deux chaînes de polynucléotides enroulées l'une autour de l'autre pour former une double hélice. L'orientation de l'hélice est généralement à droite avec les deux chaînes fonctionnant de manière antiparallèle l'une à l'autre.

La séquence de bases sur chaque brin est disposée de sorte que toutes les bases d'un brin s'apparient avec toutes les bases d'un autre brin, c'est-à-dire que le nombre de guanosines est toujours égal au nombre de cytosines et le nombre d'adénines est toujours égal au nombre de thymines .

Il y a deux sillons, un majeur et un mineur, sur la double hélice. Les protéines et les médicaments interagissent avec les groupes fonctionnels sur les bases qui sont exposées dans les rainures.

Les formes structurelles de l'ADN peuvent différer sous quatre aspects : la "maniabilité" (droite ou gauche), la longueur du tour d'hélice, le nombre de paires de bases par tour et la différence de taille entre le sillon majeur et le sillon mineur. La forme structurelle la plus courante de l'ADN est la forme B.

La structure secondaire de l'ARN consiste en un seul polynucléotide. L'ARN peut se replier de sorte que l'appariement des bases se produise entre des régions complémentaires. Les molécules d'ARN contiennent souvent à la fois des régions simple brin et double brin. Les brins sont antiparallèles et prennent une forme hélicoïdale. Les hélices sont de la forme A (voir ci-dessus).

La structure de l'ARN t (transfert) et r (ribosomique) se compose de plusieurs structures tige-boucle simple brin. Les tiges sont constituées d'hélices formées par appariement de bases de régions complémentaires au sein de l'ARN. La structure secondaire de l'ARNt et de l'ARNr est importante pour leurs fonctions biologiques, l'ARNm assume également un certain degré de structure secondaire mais pas dans la même mesure que l'ARNt et l'ARNr.

Modification chimique :

Certaines des bases de l'ADN et de l'ARN peuvent être modifiées chimiquement par méthylation. Des enzymes, similaires aux protéases, appelées exo- et endo-nucléases, peuvent cliver l'ARN et l'ADN. Les exonucléases clivent les acides nucléiques des extrémités. Les endonucléases reconnaissent des séquences spécifiques d'ADN duplex et clivent en un site spécifique à l'intérieur ou à proximité de la séquence reconnue. Les séquences reconnues ont une longueur de quatre à huit paires de bases. Les fragments résultants peuvent être joints à d'autres fragments pour créer de nouvelles combinaisons de séquences d'ADN.

L'ADN peut être dénaturé en brins simples et renaturé en une double hélice. La dénaturation réversible est essentielle pour les processus biologiques de réplication et de transcription et pour les techniques de biologie moléculaire telles que le transfert de Southern et les réactions en chaîne par polymérase (PCR). Il existe trois façons de dénaturer l'ADN : par voie enzymatique, chimique ou par la chaleur. La dénaturation de l'ADN par la chaleur peut être suivie avec un spectrophotomètre réglé sur une longueur d'onde de 260 nm. L'absorption augmente avec l'augmentation de la chaleur, rompant les liaisons hydrogène qui maintiennent les brins ensemble, désempilant et exposant les bases. Cet effet est appelé effet hyperchromique. La température à laquelle 50% de l'ADN est dénaturé est appelée température de fusion ou Tm. Parce que les paires de bases GC sont maintenues ensemble par trois liaisons hydrogène (AT n'en a que deux), plus le pourcentage de paires de bases GC est élevé, plus le T est élevé.m nécessaire pour faire fondre l'ADN.

Pour que la renaturation ait lieu, les deux brins d'ADN doivent entrer en contact l'un avec l'autre pour initier l'appariement des bases. Une fois que cela se produit, les deux brins se réassocient rapidement sur toute leur longueur. Plusieurs facteurs influencent la renaturation : la complexité, la concentration en ADN, la concentration en cations et la température. Des cations tels que le sodium, le potassium et le magnésium diminuent la répulsion intermoléculaire des squelettes phosphates chargés négativement des deux brins d'ADN. La renaturation ne se produira que si la température est inférieure à la Tm, cependant si la température est trop basse, le taux de renaturation diminuera. Des études ont montré que la plupart de l'ADN renaturé des mammifères est constitué de séquences répétitives, dont seulement 5 % environ sont des séquences uniques codant pour des protéines et des enzymes.

L'hybridation peut se produire entre des brins complémentaires d'acides nucléiques dérivés de sources différentes. L'acide nucléique double brin qui se forme est un hétéroduplex et l'étendue des hétéroduplex indique une homologie entre les deux sources d'acide nucléique. Par exemple, les humains et les souris se mélangent avec une très petite fraction de l'ADN renaturant mais les humains et les chimpanzés donnent une homologie supérieure à 98 %. L'ADN et l'ARN peuvent également s'hybrider l'un avec l'autre pour former des hétéroduplexes.


La structure de l'ARN

Il y a un deuxième acide nucléique dans toutes les cellules appelé acide ribonucléique, ou ARN. Comme l'ADN, l'ARN est un polymère de nucléotides. Chacun des nucléotides de l'ARN est composé d'une base azotée, d'un sucre à cinq carbones et d'un groupe phosphate. Dans le cas de l'ARN, le sucre à cinq carbones est le ribose et non le désoxyribose. Le ribose a un groupe hydroxyle au niveau du carbone 2', contrairement au désoxyribose, qui n'a qu'un atome d'hydrogène (Figure 9.1.4).

Figure 9.1.4 : La différence entre le ribose trouvé dans l'ARN et le désoxyribose trouvé dans l'ADN est que le ribose a un groupe hydroxyle au carbone 2'.

Les nucléotides d'ARN contiennent les bases azotées adénine, cytosine et guanine. Cependant, ils ne contiennent pas de thymine, qui est plutôt remplacée par de l'uracile, symbolisé par un &ldquoU.&rdquo L'ARN existe sous la forme d'une molécule simple brin plutôt que d'une hélice double brin. Les biologistes moléculaires ont nommé plusieurs types d'ARN sur la base de leur fonction. Ceux-ci comprennent l'ARN messager (ARNm), l'ARN de transfert (ARNt) et l'ARN ribosomique (ARNr) et les molécules mdash qui sont impliquées dans la production de protéines à partir du code ADN.


Thérapie génique non virale : conception et application de nanoplexes inorganiques

Mario Viñambres Panizo , . Marzia Marciello , dans Nucleic Acid Nanotheranostics , 2019

2 Conception de nanoplex inorganique : Considérations générales

L'application des NP inorganiques dans la livraison de gènes est un domaine émergent car ce sont des nanostructures qui peuvent être facilement préparées avec différentes tailles et formes. De plus, ils peuvent être fonctionnalisés de diverses manières pour échapper au système réticulo-endothélial, prolongeant leur demi-vie de circulation sanguine et protégeant les acides nucléiques transportés et/ou les ligands conjugués pour atteindre les cellules cibles. 9,11-14 Au NPs, SPIONs, QDs et CNTs sont les NPs inorganiques les plus étudiées. Ces particules présentent des avantages importants par rapport aux nanosystèmes organiques, tels que de meilleures efficacités de transfection, 12,15 non sujettes aux attaques microbiennes, 10,14 une plus grande stabilité de stockage, un faible coût de fabrication et une durée de conservation plus longue. 14,16,17 En outre, ils présentent des propriétés électriques, mécaniques, optiques et magnétiques uniques qui sont moins courantes dans les particules polymères. 18,19 Certaines avancées remarquables dans l'application des NP métalliques et des nanomatériaux à base de carbone sont rapportées, respectivement, dans les tableaux 1 et 2 .

Tableau 1 . Résumé de certaines avancées dans l'application des NP Au, des QD et des SPION pour la thérapie génique non virale

MatérielComposition et fonctionnalisationConstatations d'occasion/principales proposéesModèle de testRéférence
Au NPNanoparticules d'or coiffées de PEI conjuguées à des siRNA ciblant les kinases endogènes du cycle cellulairePour réguler à la baisse la kinase de type polo de l'oncogène 1. Le complexe de nanoparticules a donné 60% de knockdown et une toxicité cellulaire insignifiante lorsque 40 nM de siRNA ont été utilisésCellules MDA-MB-435sChanson 2010 43
Au NPADN à terminaison thiol attaché à AuNP puis hybridé avec l'ADN fonctionnel donneur de dystrophine. La protéine Cas9 a été adsorbée par affinitéAméliorer la transfection de l'outil d'édition de gènes CRISPR/Cas9 et modifier le gène muté de la dystrophine. 3,3% des myoblastes ont été réparésmdx modèle de sourisLee 2017 155
QDQD core-shell CdSe/ZnS. Revêtement en poly(éthylène glycol), poly-ɛ-caprolactone et polyéthylène imine. SiARN conjugué à la fluorescence contre GAPDHSuivre et prouver la séparation de l'ADN des complexes QDs-nanocarriers par une technique d'imagerie basée sur le FRETCellules SKOV3Endres 2014 60
QDNoyau Mn:ZnSe. Enrobage de poly(chlorhydrate d'allylamine) et acide folique pour la transfection médiée par les récepteurs. siARN contre le silence K-Ras mutéLe gène K-Ras a été réduit au silence dans 60%. Cytotoxicité non observée jusqu'à 160 g mL − 1 Cellules Panc-1Wang 2015 61
SPIONNanoparticules commerciales Polymag complexées avec un plasmide (pCIKLux) portant un gène rapporteur de la luciféraseTo apply an oscillating magnet to improve the magnetofection technique up to 6 times compared with original magnetofection protocolNCI-H292 cellsMcBain 2008 80
SPIONNanocluster containing SPIONs of 5 nm, fluorescent Rhodamine B in a matrix polymer of poly(lactide-co-glycolide) and PEI coating, and conjugated with pDNA containing the GFP reporterTo track the complex by both fluorescence imaging and MRI. 39% of GFP expression and nontoxic effects for 96 hours at a concentration of 200 μg mL -1 Human mesenchymal stem cells (hMSCs)Park 2017 83

AuNP, gold nanoparticle FRET, fluorescence resonance energy transfer GAPDH, glycéraldéhyde-3-phosphate déshydrogénase GFP, green fluorescent protein IRM, molecular resonance imaging PEI, polyethylenimine pDNA, plasmid DNA QD, quantum dot siARN, short interfering RNA SPION, superparamagnetic iron oxide nanoparticle.

Tableau 2 . Summary of Some Outstanding Progress in the Application of Graphene and GO Nanomaterials for Nonviral Gene Therapy

MatérielFormeFunctionalizationProposed Use/Major FindingsTesting ModelRéférence
Graphene/GONanosheetsPAMAM + OA13-Fold increase in transfection efficiency with respect to grapheneHeLa cells and MG-63 cellsLiu 2014 124
ALLERNanosheetsPEICodelivery of siRNA and doxorrubicine for anticancer therapyB-cell lymphoma 2 cellsZhang 2011 137
ALLERNanosheetsPEG + PEINanocarriers with photothermally enhanced intracellular trafficking via NIR for light-controllable gene deliveryHeLa cells and MDA-MB-435s cellsFeng 2013 134
ALLERNanosheetsPEIDelivery of VEGF-165 gene for acute myocardial infarctionIntramyocardial injection in ratPaul 2014 138
ALLERQDsPLL + PEGMicroRNAs imaging analysis and gene deliveryHeLa cellsDong 2015 132
ALLERNanosheetsPL-PEG + CPPsImproved hydrocolloidal stability and siRNA transfection efficiencyMCF-7 cellsImani 2016 136
ALLERQDsCodelivery of MPG-2H1 chimeric peptide and plasmid DNA for simultaneous gene delivery and trackingHEK 293T cellsGhafary 2017 133

CPP, cell penetrating peptide ADN, deoxyribonucleic acid ALLER, graphene oxide NIR, near-infrared light OA, oleic acid PAMAM, polyamidoamine CHEVILLE, poly(ethylene glycol) PEI, polyethylenimine PLL, poly( l -lactide) PL-PEG, phospholipid-based poly(ethylene glycol) QDs, quantum dots ARN, ribonucleic acid siARN, short interfering RNA VEGF, vascular endothelial growth factor.

With the aim of forming a stable complex with the carried therapeutic nucleic acid, the surface of the inorganic NPs needs to be chemically modified. Specifically, surface modifications are performed for different objectives: (1) to allow a stable conjugation of the carried nucleic acid (2) to protect the NPs from opsonization (3) to increase the selective cellular binding and (4) to allow internalization through receptor-mediated endocytosis. 3

After modification of the NP surface, the therapeutic gene is carried using different strategies. Depending on the type of chemical NP-nucleic acid association, inorganic vectors can be differently categorized as: (1) vectors that form a condensed complex with the nucleic acid, protecting it from nucleases and other blood components (2) nanocarriers that expose specific ligands for target cells (3) nanovectors able to improve the release of the genetic material into the cytosol or nucleus and (4) nanosystems that prolong the release of the therapeutic gene in tissues. 1

Typical chemical modifications /conjugations can be obtained by establishing three main kinds of bonds:

Weak bindings—These are generally represented by electrostatic interactions that lead to the formation of reversible bonds. Normally, they are based on the attraction between positively and negatively charged species and can easily be broken under high salt concentrations. Some examples are ionic bindings, hydrogen bonds, and Van der Waals forces. 20

Weak interactions are preferred for the complexation of the nucleic acid with the NPs because the therapeutic can be easily released into the cell, while also avoiding chemical modifications of it. An interesting example is represented by multiple electrostatic layers on the surface of NPs that can be deposited using a layer-by-layer (LbL) approach. 21

Strong bonds—They are usually characterized by irreversible conjugations. They are resistant to high-force ionic conditions differently from electrostatic interactions. Generally, they are formed between different functional groups (e.g., carboxylic acids, amines, thiols), forming very strong bonds, such as amide, ester, or disulfide bridges. 20

The metal-ligand interaction between Au and thiolated molecules, 22 as well as the binding affinity of protein-ligand (including lock-and-key, induced fit, and conformational selection models) 23,24 are also included in this category of conjugation.

Versatile and quick click chemistry reactions can be used to obtain some reactions that lead to the formation of resistant bonds. These include, for example, cycloadditions (e.g., 1,3-dipolar cycloadditions of alkynes to azides, hetero-Diels-Alder cycloadditions), nucleophilic ring openings consisting of opened strained heterocyclic electrophiles (e.g., aziridines, epoxides, cyclic sulfates), and additions to carbon-carbon multiple bonds (e.g., epoxidations, aziridinations, dihydroxylations, sulfenyl halide additions, nitrosyl halide additions, and certain Michael additions). 25,26

Encapsulation—It leads to the formation of hybrid nanomaterials based on the entrapment of inorganic particles with the therapeutic into a polymer. 27 This polymer can be stimuli-sensitive, so able to release its contents in the presence of specific conditions (typically temperature and pH). 28,29


Nucleotides and Bases

Nucleotide Structure
Courtesy of the National Human Genome Research Institute

Nucléotides

A nucleotide is the basic structural unit and building block for ADN. These building blocks are hooked together to form a chain of DNA. A nucleotide is composed of 3 parts:

* five-sided sugar
* phosphate group
* nitrogenous base (nitrogen containing)

Image courtesy of the National Human Genome Research Institution

The sugar and phosphate group make up the backbone of the DNA double helix, while the bases are located in the middle. A chemical bond between the phosphate group of one nucleotide and the sugar of a neighboring nucleotide holds the backbone together. Chemical bonds (hydrogen bonds) between the bases that are across from one another hold the two strands of the double helix together.

There are four types of bases in DNA. They are called:

* Adenine (A)
* Cytosine (C)
* Guanine (G)
* Thymine (T)

Courtesy of the National Human Genome Research Institution

Bases are the part of DNA that stores information and gives DNA the ability to encode phénotype, a person’s visible traits. Adenine and guanine are purine bases. These are structures composed of a 5-sided and 6-sided ring. Cytosine and thymine are pyrimidines which are structures composed of a single six-sided ring. Adenine always binds to thymine, while cytosine and guanine always bind to one another. This relationship is called complementary base paring. These complementary bases are bonded together via hydrogen bonds, which can be easily broken apart when the DNA needs to unzip and duplicate itself.

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