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10.8 : Algues vertes - Précurseurs des plantes terrestres - Biologie

10.8 : Algues vertes - Précurseurs des plantes terrestres - Biologie


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Streptophytes

Jusqu'à récemment, tous les eucaryotes photosynthétiques étaient considérés comme des membres du royaume Plantae. En effet, outre leur capacité à capter l'énergie lumineuse et à fixer le CO2, ils manquent de nombreux traits structuraux et biochimiques qui distinguent les plantes des protistes. Les algues vertes contiennent les mêmes caroténoïdes et chlorophylle une et b comme plantes terrestres, alors que d'autres algues ont des pigments accessoires et des types de molécules de chlorophylle différents en plus de la chlorophylle une. Par conséquent, les plantes terrestres et les algues vertes étroitement apparentées font désormais partie d'un nouveau groupe monophylétique appelé Streptophyta.

Les algues vertes restantes, qui appartiennent à un groupe appelé Chlorophyta, comprennent plus de 7 000 espèces différentes qui vivent dans les eaux douces ou saumâtres, dans l'eau de mer ou dans les plaques de neige. Quelques algues vertes survivent même sur le sol, à condition qu'il soit recouvert d'une fine pellicule d'humidité dans laquelle elles peuvent vivre. Les périodes de sécheresse périodiques offrent un avantage sélectif aux algues qui peuvent survivre au stress hydrique. Certaines algues vertes sont peut-être déjà familières, en particulier Spirogyre et desmides. Leurs cellules contiennent des chloroplastes qui présentent une variété vertigineuse de formes, et leurs parois cellulaires contiennent de la cellulose, tout comme les plantes terrestres. Certaines algues vertes sont des cellules uniques, telles que Chlorelle et Chlamydomonas, ce qui ajoute à l'ambiguïté de la classification des algues vertes, car les plantes sont multicellulaires. D'autres algues, comme Ulva (communément appelée laitue de mer), forment des colonies (Figure 1).

Reproduction d'algues vertes

Les algues vertes se reproduisent à la fois de manière asexuée, par fragmentation ou dispersion de spores, ou sexuellement, en produisant des gamètes qui fusionnent lors de la fécondation. Dans un organisme unicellulaire tel que Chlamydomonas, il n'y a pas de mitose après la fécondation. Dans le multicellulaire Ulva, un sporophyte se développe par mitose après fécondation (et présente donc une alternance de générations). Les deux Chlamydomonas et Ulva produire des gamètes flagellés.

Charales

Les charophytes comprennent plusieurs ordres d'algues différents qui ont chacun été suggérés comme les plus proches parents des plantes terrestres : les Charales, les Zygnematales et les Coleochaetales. Les Charales remontent à 420 millions d'années. Ils vivent dans une gamme d'habitats d'eau douce et varient en taille de quelques millimètres à un mètre de longueur. Le genre représentatif est Chara (Figure 25.8), souvent appelée herbe musquée ou moufette en raison de son odeur désagréable. Les grandes cellules forment le thalle: la tige principale de l'algue. Les branches issues des nœuds sont constituées de cellules plus petites. Les structures reproductrices mâles et femelles se trouvent sur les nœuds et les spermatozoïdes ont des flagelles. Même si Chara ressemble superficiellement à certaines plantes terrestres, une différence majeure est que la tige n'a pas de tissu de soutien. Cependant, les Charales présentent un certain nombre de traits qui sont importants pour l'adaptation à la vie terrestre. Ils produisent les composés lignine et sporopollénine, et forment des plasmodesmes qui relient le cytoplasme des cellules adjacentes. Bien que le cycle de vie des Charales soit haplontique (la forme principale est haploïde et des zygotes diploïdes sont formés mais ont une brève existence), l'œuf, et plus tard, le zygote, se forment dans une chambre protégée sur la plante mère haploïde.

Les Coléochètes sont des formes multicellulaires ramifiées ou discoïdes. Ils peuvent produire à la fois sexuellement et asexuellement, mais le cycle de vie est fondamentalement haplontique. Une analyse approfondie récente des séquences d'ADN des charophytes indique que les Zygnematales sont plus étroitement liés aux embryophytes que les Charales ou les Coleochaetales. Les Zygnematales comprennent le genre familier Spirogyre, ainsi que les desmides. Au fur et à mesure que les techniques d'analyse de l'ADN s'améliorent et que de nouvelles informations sur la génomique comparative apparaissent, les connexions phylogénétiques entre les charophytes et les plantes terrestres continueront d'être examinées pour apporter une solution satisfaisante au mystère de l'origine des plantes terrestres.


Plantes I

Chez les bryophytes, les gamétophytes sont la phase la plus importante et la plus visible du cycle de vie.

Le gamétophyte est haploïde et produit des gamètes haploïdes par mitose.

Les nutriments sont transférés du parent à l'embryon par les cellules de transfert placentaire.

Les cellules diploïdes appelées sporocytes subissent une méiose pour générer des spores haploïdes.

Les gamétanges femelles, appelées archégones, produisent des œufs et sont le site de la fécondation.

Les rhizoïdes ancrent les gamétophytes au substrat.

La sphaigne, ou "mousse de tourbe", forme de vastes dépôts de matière organique partiellement décomposée connue sous le nom de tourbe.

Le phloème est constitué de cellules vivantes et distribue des sucres, des acides aminés et d'autres produits organiques.

Ils permettent aux plantes vasculaires d'absorber l'eau et les nutriments du sol.

Les feuilles sont classées en deux types :
Microphylles, feuilles à nervure unique.
Mégaphylles, feuilles avec un système vasculaire très ramifié.


Fond

Les stérols sont des composants vitaux de toutes les cellules eucaryotes [1]. Chez les plantes supérieures, ils jouent un rôle structurel dans la viabilité cellulaire, l'embryogenèse, la formation de motifs, la division cellulaire, la biogenèse des chloroplastes et la modulation de l'activité et de la distribution des protéines liées à la membrane telles que les enzymes et les récepteurs [2, 3]. De plus, les stérols sont des précurseurs de nombreuses molécules de signalisation qui régulent la croissance et le développement des plantes et des animaux, telles que les hormones de mue des insectes ecdystéroïdes [4], les hormones stéroïdes des mammifères [5] et les hormones brassinostéroïdes végétales (BR) [6].

Les stérols appartiennent à une classe d'isoprénoïdes dérivés de l'isopentényl pyrophosphate (IPP), un précurseur universel des isoprénoïdes. Chez les animaux et les champignons, la voie de l'acide mévalonique cytoplasmique (MVA) est la seule voie de biosynthèse de l'IPP, la pierre angulaire du lanostérol, qui est ensuite métabolisé en cholestérol chez les animaux et en ergostérol chez les champignons [7]. Chez les plantes supérieures, l'IPP peut être dérivée soit par la voie MVA, soit par la voie plastidiale du 1-désoxyxylulose 5-phosphate ou du méthylérythritol phosphate (MEP), bien que la première soit le principal contributeur à la biosynthèse des stérols [8, 9]. Dans Arabidopsis, les mutants biosynthétiques des stérols peuvent être classés en deux groupes distincts : les mutants BR-indépendants, qui sont défectueux dans les gènes de la voie allant du cycloarténol au 24-méthylènelophénol [10], et les mutants BR-dépendants, qui sont défectueux dans les gènes à cette dernière partie de la voie de biosynthèse des stérols (du 24-méthylènelophénol au campestérol, qui est considéré comme le précurseur des BR) [11]. En plus de servir de précurseur de BR, les stérols semblent jouer des fonctions de signalisation distinctes au cours du développement de la plante, car les phénotypes de mutants biosynthétiques de stérols ne peuvent pas être sauvés par l'ajout de BR exogène [12].

La corégulation de la synthèse des stérols et de la production d'acides gras (AG) est essentielle pour maintenir l'équilibre biosynthèse versus renouvellement des membranes au cours de la croissance cellulaire [13]. Chez les animaux, les stérols et les AG sont régulés de manière coordonnée par un système de rétroaction médié par une famille conservée de facteurs de transcription appelés protéines de liaison aux éléments régulateurs des stérols (SREBP), qui contrôle une cascade d'enzymes biosynthétiques pour le cholestérol endogène, FA, triacylglycérol (TAG) et phospholipide [14, 15]. La SREBP activée se lie aux éléments de réponse aux stérols dans les régions promotrices et/ou amplificatrices des gènes cibles et induit la transcription d'au moins 30 gènes de synthèse du cholestérol et des lipides (en particulier ceux codant pour des enzymes limitant la vitesse, telles que l'hydroxy-méthyl-glutaryl-CoA réductase, HMGR et FA synthase de type I, FAS) [16]. La manipulation de cette cascade régulatrice chez les souris transgéniques a entraîné des augmentations de 6 et 22 fois de la teneur en cholestérol et de la teneur en TAG, respectivement, et par conséquent des foies gras massifs [17].

Les microalgues sont des matières premières prometteuses pour la production durable et évolutive de biocarburant [18] cependant, peu de souches de microalgues trouvées dans la nature sont dotées du large éventail de traits exigés par un schéma de production à grande échelle et économiquement compétitif [19]. Il est donc urgent d'identifier des molécules et des mécanismes qui régulent la croissance, le développement et les réponses au stress des microalgues pour l'amélioration des souches. Les stérols dans les microalgues présentent une énorme diversité en raison du degré élevé d'hétérogénéité phylogénétique, du grand nombre de genres et de la longue distance évolutive entre beaucoup d'entre eux [20, 21]. Il a longtemps été démontré que dans les microalgues, la composition des stérols varie en fonction des changements de stade de croissance, de spectre lumineux ou de température, suggérant des rôles importants mais largement inconnus des stérols [22]. Par conséquent, la manipulation de la biosynthèse et de la régulation des stérols offre un potentiel pour l'ingénierie de la production de lipides. L'exploration du mécanisme de régulation de la lipogenèse dépendante des stérols chez les microalgues pourrait fournir de nouvelles stratégies et cibles pour une production accrue de lipides chez les microalgues. Cependant, on sait peu de choses sur les rôles, la biosynthèse et la régulation des stérols dans les microalgues et en particulier, si et comment le métabolisme des stérols et des AG est co-régulé.

Nannochloropsis spp. sont un genre de microalgues photosynthétiques unicellulaires appartenant aux hétérocontes. Ils sont largement répandus dans le milieu marin ainsi que dans les eaux douces et saumâtres. Ces algues présentent un intérêt industriel car elles se développent rapidement et peuvent synthétiser de grandes quantités de TAG et d'AG polyinsaturés de grande valeur (par exemple, l'acide eicosapentaénoïque) [23]. Les génomes de plusieurs espèces d'oléagineux Nannochloropsis spp. ont été séquencés et annotés [23–27]. Utilisation d'une microalgue industrielle oléagineuse N. océanique IMET1 comme modèle, cette étude visait à déterminer la composition des stérols et la voie de biosynthèse dans les microalgues, à étudier le rôle de la biosynthèse des stérols dans la photosynthèse et la croissance, à étudier l'influence de l'apport de lumière et d'azote, et à sonder les effets des niveaux de stérols sur l'accumulation d'AF. Nos résultats élargissent la compréhension de la fonction des stérols dans les microalgues et devraient aider le génie génétique ou les procédés rationnels pour la production à base de microalgues de biocarburants ou d'autres bioproduits à valeur ajoutée.


Structure et mécanisme de l'enzyme végétale unique évolutivement chalcone isomérase

La chalcone isomérase (CHI) catalyse la cyclisation intramoléculaire de la chalcone synthétisée par la chalcone synthase (CHS) en (2S)-naringénine, composé essentiel à la biosynthèse des pigments anthocyanes, inducteurs de Rhizobium les gènes de nodulation et les phytoalexines antimicrobiennes. La structure cristalline de résolution 1,85 Å de la luzerne CHI en complexe avec (2S)-naringénine révèle un nouveau pli en sandwich β à face ouverte. Actuellement, les protéines avec des séquences primaires homologues ne se trouvent que dans les plantes supérieures. La topologie de la fente du site actif définit la stéréochimie de la réaction de cyclisation. La structure et l'analyse mutationnelle suggèrent un mécanisme dans lequel la complémentarité de forme de la fente de liaison verrouille le substrat dans une conformation contrainte qui permet à la réaction de se dérouler avec une constante de vitesse de second ordre approchant la limite de diffusion contrôlée. Cette structure soulève des questions sur l'histoire évolutive de cette enzyme végétale structurellement unique.


2. MATÉRIELS ET MÉTHODES

2.1 Conditions de culture d'algues

P. tricornutum (CCMP2561), obtenu à partir de la collection de cultures du Centre national de culture de phytoplancton marin Provasoli-Guillard, Laboratoire Bigelow pour les sciences océaniques, a été maintenu et cultivé dans un milieu F/2 contenant 20 g/L de sel marin. La souche a été notée Pt1 avec un morphotype fusiforme (De Martino et al., 2007 ). Brièvement, 10 ml de milieu liquide F/2 ont été inoculés avec des cellules provenant de plaques de gélose et l'algue a été cultivée en aérobie dans des flacons de 50 ml à 23°C pendant 6 jours (secouant la main deux fois par jour) éclairée par une lumière continue de 30 µE m − 2 s -1 (lumière du tube fluorescent blanc froid, par le haut). Les cellules d'algues ont ensuite été inoculées à 10 % (v/v) dans des flacons de 250 ml pour croissance avec agitation orbitale à 150 rpm dans un agitateur orbital (Zhichu) et illumination constante de 30 µE m -2 s -1 . Des cellules d'algues cultivées jusqu'à la phase exponentielle tardive ont été utilisées comme graines pour les expériences.

Pour le traitement de la privation d'azote (ND), les graines ont été récoltées, lavées deux fois avec du milieu F/2 dépourvu d'azote, et remises en suspension dans ce milieu. Des cellules remises en suspension dans du milieu F/2 (azote rempli, NR) ont été utilisées comme contrôle. Les deux avaient un nombre de cellules de départ de 1,5 × 10 6 ml -1 et ont été cultivés pendant 4 jours avec agitation orbitale à 150 tr/min et illumination constante de 30 µE m -2 s -1 . Pour la comparaison entre les souches de type sauvage (WT) et transgéniques de P. tricornutum, les cellules ont été inoculées à un nombre de cellules de départ de 5 × 10 5 ml -1 et laissées croître pendant 12 jours avec agitation orbitale à 150 tr/min et illumination constante de 30 µE m -2 s -1 .

2.2 Clonage et analyse in silico de P. tricornutum DGAT

Pour obtenir la séquence codante complète de PtDGAT1, ses régions non traduites ont d'abord été déterminées par amplification rapide 5' et 3' des extrémités d'ADNc (RACE)-PCR à l'aide du kit SMARTer RACE 5'/3' (TaKaRa). Ensuite, des paires d'amorces ont été utilisées pour amplifier la séquence codante complète, qui a été vérifiée par séquençage et déposée dans NCBI GenBank (numéro d'accès MN061782). Les séquences de PtDGAT2A par PtDGAT2D et PtDGAT3 ont été extraits de NCBI GenBank (JX469835, JQ837823, JX469836, JX469837 et XM_002184438).

L'alignement des séquences des polypeptides DGAT de divers organismes a été réalisé à l'aide de ClustalX2.1 (http://www.clustal.org/clustal2/) et l'arbre phylogénétique a été généré à l'aide de MEGA6 (Tamura et al., 2013). Les hélices transmembranaires de PtDGAT ont été prédites à l'aide de TMHMM 2.0 (http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/).

2.3 Isolement d'ARN et PCR quantitative en temps réel

L'extraction de l'ARN total (à partir d'environ 107 cellules d'algues) et l'élimination de l'ADN contaminé ont été réalisées en utilisant le kit d'extraction d'ARN végétal (TaKaRa). Après la synthèse de l'ADNc, une PCR quantitative en temps réel (qPCR) a été réalisée sur un système de PCR en temps réel rapide 7500 (Applied Biosystems) avec SYBR ® Premix Ex Taq™ II (TaKaRa), en suivant nos procédures décrites précédemment (Wei et al ., 2017 ). Les séquences d'amorces utilisées pour la qPCR sont répertoriées dans le tableau S1. Le niveau d'expression de l'ARNm de PtDGAT gènes a été normalisée en utilisant le gène de l'actine comme contrôle interne.

2.4 Complémentation fonctionnelle des PtDGAT chez la levure déficiente en TAG

Les six PtDGAT les gènes ont été amplifiés par PCR en utilisant l'ADNc comme matrice et clonés dans le vecteur d'expression de levure pYES2-CT (Invitrogen), en utilisant le kit de clonage In Fusion Advantage PCR (TaKaRa). Les amorces PCR pour le clonage sont répertoriées dans le tableau S1. Les plasmides recombinants, une fois confirmés par séquençage, ont chacun été introduits dans la souche quadruple mutante déficiente en TAG H1246 de Saccharomyces cerevisiae (Sandager et al., 2002). Le vecteur vide (EV) pYES2-CT a été utilisé comme contrôle négatif. Les transformants de levure, après vérification par Colony PCR, ont été cultivés dans un milieu SD/-Ura contenant 2 % (p/v) de galactose pour induire l'expression du transgène. Pour l'expérience sur les acides gras libres, l'acide linoléique (C18:2), l'acide -linolénique (C18:3n3) et l'acide eicosapentaénoïque (C20:5n3) ont chacun été introduits dans des cultures de levure par induction de galactose à une concentration de 100 µM, comme décrit par Mao et al. (2019). Après 2 jours de culture, les cultures de levure ont été récoltées pour analyse lipidique et coloration fluorescente.

2.5 Dosage in vitro des PtDGAT

L'induction de l'expression hétérologue de PtDGAT gènes dans H1246 et la préparation de microsomes à partir de ces souches de levure contenant des PtDGAT ont été menées selon nos procédures décrites précédemment (Liu et al., 2017). Les fractions microsomales préparées ont chacune été remises en suspension dans le tampon de stockage (Tris-HCl 50 mM, pH 7,5, 10 % de glycérol) pour un dosage in vitro ultérieur.

Le test DGAT in vitro a été réalisé dans un système de réaction de 200 µl, qui se compose de 20 µg de protéine microsomale, 250 µM des deux substrats acyl-CoA et DAG, et 10 mM de MgCl2 dans du tampon phosphate de potassium (Liu et al., 2017 ). DAG (16:1/16:1) a été utilisé comme accepteur d'acyle, tandis que 16:0-CoA, 16:1-CoA et C20:5-CoA ont été utilisés comme donneur d'acyle, tous ont été achetés auprès de Larodan Fine Chemicals.

2.6 Surexpression des PtDGAT dans P. tricornutum

Les séquences codantes de PtDGAT1, PtDGAT2A par PtDGAT2D et PtDGAT3 ont été chacun sous-clonés dans le P. tricornutum vecteur d'expression peGFP (Zhang & Hu, 2014), en utilisant le kit de clonage PCR In Fusion Advantage (TaKaRa). Les amorces PCR pour le clonage sont répertoriées dans le tableau S1. La métamorphose de P. tricornutum par électroporation a suivi nos protocoles décrits précédemment (Zhang & Hu, 2014). Les transformants putatifs sélectionnés sur milieu solide F/2 contenant 75 µg/ml de zéocine ont été vérifiés par PCR génomique. Ensuite, une qPCR a été réalisée pour déterminer le niveau d'expression des transgènes dans les transformants sélectionnés. Deux souches avec les niveaux d'expression les plus élevés pour chaque transgène ont été choisies pour d'autres expériences.

2.7 Analyses en microscopie fluorescente et confocale

Pour l'observation des lipides neutres dans P. tricornutum et cellules de levure, elles ont d'abord été colorées avec la fluorescence BODIPY™ 505/515 (Invitrogen) avec une concentration de travail de 1 µg/ml pendant 10 min à température ambiante, puis visualisées sous un Microscope à Fluorescence Olympus BX51 (Olympus) avec une excitation à 488 nm et émission entre 505 et 530 nm. Pour la localisation subcellulaire des PtDGAT, les souches d'algues transgéniques correspondantes ont été visualisées sous un microscope confocal à balayage laser Leica TCS SP8. La fluorescence de la GFP a été observée avec une excitation à 488 nm et une émission à 500-525 nm, et une autofluorescence de la chlorophylle a été observée avec une excitation à 488 nm et une émission à 650-750 nm. Pour observer le noyau des cellules d'algues, elles ont été colorées avec Hoechst 33342 (Invitrogen) à une concentration de 5 µM pendant 30 min à température ambiante puis visualisées avec excitation à 405 nm et émission à 425-475 nm.

2.8 Méthodes analytiques

Comptage cellulaire à l'aide d'un hémocytomètre sous microscope optique et détermination gravimétrique du poids sec pour P. tricornutum suivi nos procédures décrites précédemment (Liu et al., 2019). Le rendement quantique maximal du PSII, Fv/Fm ou FmFo/Fm, a été mesurée sur une fluorométrie à modulation d'amplitude d'impulsion (PAM) (Water-PAM, Walz), en utilisant une cellule d'algue adaptée à l'obscurité pendant 2 heures (Liu et al., 2019) : Fo a été enregistré sous une faible lumière (<10 μmol m −2 s −1 , culminant à 650 nm) et Fm était sous une impulsion saturante (0,8 s) de lumière rouge (3 000 μmol m -2 s -1 , culminant à 660 nm). Teneur en protéines dans P. tricornutum cellules a été déterminée selon Meijer et Wijffels (1998), en utilisant des échantillons d'algues lyophilisés. Teneur en glucides dans P. tricornutum cellules a été déterminée par la méthode colorimétrique (Renaud et al., 1999 ), après hydrolyse des échantillons d'algues lyophilisées avec 4 M H2DONC4.

Les lipides de levure et P. tricornutum les cellules ont été extraites avec du chloroforme-méthanol (2:1, v/v) comme décrit précédemment par Mao et al. (2019). Pour l'analyse par chromatographie sur couche mince (CCM), les lipides extraits ont été séparés sur une plaque de CCM au gel de silice 60 (Merck) en utilisant un mélange d'hexane/éther de tert-butylméthyle/acide acétique (80/20/2, en vol) comme phase mobile (Liu et al., 2016 ). Après séparation, le TAG sur la plaque TLC a été visualisé avec de la vapeur d'iode, récupéré et transestérifié avec de l'acide sulfurique à 1,5 % dans du méthanol à 85 °C pendant 2,5 heures. Lipides totaux de P. tricornutum et les cultures de levure et les produits de réaction des tests DGAT in vitro ont été directement transestérifiés.

Les esters méthyliques d'acides gras préparés à partir de la transestérification des lipides ont été analysés à l'aide d'un chromatographe en phase gazeuse capillaire Agilent 7890 équipé d'un détecteur de spectrométrie de masse 5975 C et d'une colonne capillaire HP-88 (60 m × 0,25 mm Agilent Technologies), en suivant nos procédures décrites précédemment. (Liu et al., 2016 ).


Procédures expérimentales

Matériel végétal et conditions de croissance

Plantes mutantes et transgéniques d'Arabidopsis (Arabidopsis thaliana) étaient dans le fond de type sauvage Col-0. Les graines d'Arabidopsis ont été semées sur compost, stratifiées pendant 3 jours à 4°C et cultivées à 20°C, sous CO ambiant2 (Californie. 400 μmol/mol), à 70 % d'humidité relative et sous 100 μmol de photons/m 2 /s dans des cycles de lumière de 12 h / 12 h d'obscurité, sauf indication contraire.

Pour les analyses de lignées transgéniques, l'insertion homozygote ou les lignées de type sauvage hors ségrégation (T3) ont été comparées. Lorsque des ségrégeants de type sauvage n'étaient pas disponibles, des lignées d'insertion homozygotes ont été comparées à des plantes Col-0 provenant de stocks de graines du même âge générés dans des conditions similaires. Plants de tabac (Nicotiana benthamiana L.) ont été cultivés dans des conditions de serre (minimum 20 °C, lumière naturelle complétée pour donner au moins 12 h de lumière). Les protéines marquées par Vénus ont été exprimées dans la souche sauvage de Chlamydomonas cMJ030 (CC-4533) (Zhang et al., 2014 ). Les cellules ont été maintenues dans une faible luminosité constante (

10 μmol de photons/m 2 /s) à température ambiante sur des plaques de gélose à 1,5 % (p/v) contenant du Tris–acétate–phosphate (TAP) (Kropat et al., 2011 ). Pour l'imagerie, les cellules ont été cultivées dans un milieu TAP liquide à une concentration de 10 6 cellules/mL, sédimentées par centrifugation (1000 g, 4 min), remis en suspension dans un milieu minimal Tris–phosphate (T-P) (Kropat et al., 2011 ) et cultivée pendant 24 h dans du CO ambiant2 avant l'imagerie.

Clonage et expression des composants du CCM chez Chlamydomonas

Les cadres de lecture ouverts (ORF) des gènes de Chlamydomonas ont été exprimés en cadre avec Vénus de la PsaD promoteur utilisant le vecteur pLM005. Les ORF ont été amplifiés à partir d'ADN génomique en utilisant la polymérase Phusion Hotstart II (Thermo Fisher Scientific, www.thermofisher.com) avec les oligos respectifs dans le tableau S1. Le vecteur pLM005 coupé en Hpal et les produits PCR ont été purifiés sur gel et assemblés par assemblage Gibson (Gibson et al., 2009 ). En raison de la grande longueur des gènes de HLA3, il a été cloné en deux fragments puis assemblé dans le vecteur pLM005 par assemblage Gibson. Le vecteur pLM005 contient le gène AphVIII pour la résistance à la paromomycine chez Chlamydomonas et la résistance à l'ampicilline pour la sélection bactérienne. Toutes les jonctions de construction ont été vérifiées par séquençage de Sanger. Les constructions ont été transformées en Chlamydomonas par électroporation comme dans Zhang et al. (2014). Brièvement, 250 L de 2 x 108 cellules/mL ont été transformés avec 14,5 ng/kpb de plasmide coupé par EcoRV à 16°C. Les cellules ont été étalées sur des plaques de gélose TAP de 86 mL contenant de la paromomycine (20 g/mL) et maintenues en basse lumière (

10 μmol de photons/m 2 /s) jusqu'à ce que les colonies soient

2 à 3 mm de diamètre. Les plaques ont été criblées pour les colonies fluorescentes à l'aide d'un scanner à fluorescence Typhoon TRIO (GE Healthcare, www.gelifesciences.com) avec des longueurs d'onde d'excitation/émission de 532 nm/520-555 nm pour Vénus et 633 nm/630-670 nm pour l'autofluorescence de la chlorophylle.

Clonage et expression des composants du CCM dans le tabac et Arabidopsis

Les gènes ont été clonés à partir d'ADNc dérivé de Chlamydomonas (souche CC-4886, Chlamydomonas Resource Center). Les amorces ont été conçues à partir de séquences disponibles sur Phytozome v10.2 (Chlamydomonas reinhardtii v5.5 [Augustus u11.6], http://phytozome.jgi.doe.gov/pz/portal.html#!info?alias=Org_Creinhardtii) (voir le tableau S1 pour les détails sur les oligo). Séquences de gènes pour LCIA et HLA3 ont été optimisés pour les codons pour l'expression dans les plantes supérieures et synthétisés de novo (DNA2.0, CA, USA) (Figure S7), puis cloné dans des vecteurs d'entrée Gateway (pCR ® 8/GW/TOPO ® TA Cloning ® Kit) en utilisant Platinum ® Taq DNA Polymerase High Fidelity selon les instructions du fabricant (Invitrogen ™ Life Technologies, www.lifetechnologies.com) et ensuite cloné dans les vecteurs binaires de destination pK7FWG2,0 (Karimi et al., 2002 ) ou pGWB5 (Nakagawa et al., 2009 ). L'assemblage Gibson a été utilisé pour générer des fusions de gènes de peptides de transit. Les vecteurs binaires ont été transformés en Agrobacterium tumefaciens (AGL1) pour l'expression transitoire des gènes dans les feuilles de tabac (Schöb et al., 1997 ) ou insertion stable dans les plantes d'Arabidopsis par trempage floral (Clough et Bent, 1998 ). Des études de co-expression ont été réalisées avec le vecteur WAVE131 de l'ensemble de marqueurs « wave » (Geldner et al., 2009 ) et le vecteur mt-rb (Nelson et al., 2007) pour la localisation de la membrane plasmique et des mitochondries, respectivement.

Extraction d'ADN, PCR et analyse de protéines

Pour le criblage de lignées transgéniques d'Arabidopsis, l'ADN génomique a été extrait de rosettes matures non florifères de plantes T1 comme décrit dans Li et Chory (Li et Chory, 1998). Les PCR ont été réalisées comme dans McCormick et Kruger ( 2015 ). Dans la mesure du possible, l'emplacement des inserts de gènes a été confirmé par TAIL PCR comme décrit par Liu et al. (1995). Des lignées d'insertion homozygotes ont été identifiées dans la génération T2 soit par PCR, soit par des rapports de ségrégation des semis sur des plaques de milieu Murashige et Skoog (MS) contenant de la kanamycine (0,5x).

Les niveaux relatifs de LCIA : GFP et HLA3 : protéines GFP dans les feuilles ont été confirmés par immunoblot. Environ 10 g de protéines provenant de rosettes entières de 28 jours (100 mg de poids frais) ont été fractionnés par SDS-PAGE sur un gel d'acrylamide à 10 % (p/v) : bisacrylamide (40 : 1) transféré sur membrane PVDF, sondé avec la souris IgG anti-GFP2a à une dilution de 1:1000 (Santa Cruz, http://www.scbt.com/) et visualisé à l'aide d'une IgG anti-souris de chèvre conjuguée à HRP2a à 1:50 000 dilution. L'activité HRP a été détectée à l'aide de Supersignal Ultra (Pierce, www.piercenet.com) selon les instructions du fabricant.

Tests d'expression ovocytaire et d'absorption de bicarbonate

Séquences génétiques synthétisées pour mature LCIA (mLCIA) ou HLA3 manquant d'un codon stop ont été clonés dans le vecteur d'expression Vivid Colors™ pcDNA™ 6.2/EmGFP (Invitrogen™ Life Technologies) pour générer des fusions mLCIA- ou HLA3-GFP. Pour LCIA, le peptide de séquence de transit N-terminal (73 aa) a été retiré et remplacé par la séquence « GACATG » pour ajouter une séquence Kozak et un nouveau codon de démarrage. Pour HLA3, 'GAC' a été ajouté immédiatement en amont du codon de départ. Pour générer des vecteurs équivalents dépourvus d'une étiquette fluorescente, l'assemblage de Gibson a été utilisé pour ajouter un codon d'arrêt à mLCIA ou HLA3 et retirer la séquence GFP (720 pb). Les plasmides ont été linéarisés par AvrII ou StuI (Roche, www.roche.co.uk) et l'ARNm coiffé a été synthétisé en utilisant le kit de transcription mMESSAGE mMACHINE® T7 (Ambion® Life Technologies) selon les instructions du fabricant. L'ARNm LCIA mature ou HLA3 a été exprimé dans les ovocytes comme décrit par Feng et al. (2013). Les ovocytes de Xenopus ont reçu une injection de 50 nL d'ARNm (1 g/μL) ou d'eau traitée au pyrocarbonate de diéthyle (DEPC) comme témoin. Des tests d'absorption de bicarbonate et une imagerie confocale ont été effectués 3 jours après l'injection dans un protocole adapté de Mariscal et al. (2006). Les ovocytes ont été incubés dans des milieux MBS frais (88 m m NaCl, 1 m m KCl, 2,4 m m NaHCO3, 0,71 m m CaCl2, 0,82 m m MgSO4 et 15 m m HEPES, pH 7,4), contenant 0,12 m m NaHCO3 (1,85 GBq/mol NaH 14 CO3). Après 10 min, les ovocytes ont été lavés trois fois avec du MBS glacé et lysés dans 200 L de SDS (10 % [w/v]), et la radioactivité retenue dans les ovocytes individuels a été mesurée.

Quantification de la chlorophylle

La chlorophylle a été extraite de disques de feuilles en poudre dans de l'acétone glacé à 80 % (v/v) et du Tris-HCl 10 m m, et la concentration a été mesurée selon Porra. et al. ( 1989 ).

Mesure des paramètres photosynthétiques

Les taux d'échange de gaz ont été déterminés à l'aide d'un analyseur de gaz infrarouge portable LI-6400 (LI-COR Biosciences, http://www.licor.com/) sur la sixième ou la septième feuille de 35 à 45 jours matures, non florifères rosettes cultivées dans de grands pots pour générer une surface foliaire suffisante pour les mesures des échanges gazeux (Flexas et al., 2007 ). La réponse du CO photosynthétique net2 assimiler (UNE) au CO sous-stomatique2 concentration (Cje) a été mesurée en faisant varier le CO externe2 concentration de 0 à 1000 mol/mol sous un rayonnement photosynthétique actif constant de 1500 μmol photons/m 2 /s (fourni par une source lumineuse rouge-bleue attachée à la chambre foliaire). Les données d'échange de gaz ont été corrigées pour le CO2 diffusion comme à Bellasio et al. (2015). La température des feuilles et l'humidité relative de la chambre ont été maintenues à 21 °C et 70 %, respectivement. Pour calculer le taux de carboxylation maximum (Vc, max), le flux de transport d'électrons maximum (Jmax) et la conductance du mésophylle (gm), les données A/Ci ont été ajustées au C3 modèle de photosynthèse (Farquhar et al., 1980 ) avec des modifications pour inclure des estimations pour gm tel que décrit par Ethier et Livingston (2004).

Microscopie confocale à balayage laser

Un microscope confocal à balayage laser Leica TCS SP2 (Leica Microsystems) avec un objectif à immersion dans l'eau (HCX IRAPO 25,0 x 0,95) a été utilisé pour l'imagerie des feuilles et des ovocytes. Les longueurs d'onde d'excitation/émission étaient de 488 nm/500-530 nm pour la GFP, 543 nm/590-620 nm pour mCherry et 488 nm/680-750 nm pour l'autofluorescence de la chlorophylle. Les images ont été acquises à l'aide du logiciel Leica LAS AF (http://www.leica-microsystems.com/). Avant l'imagerie des protéines marquées par Vénus dans Chlamydomonas, 15 L de cellules ont été ajoutés à un puits d'une plaque optique à 96 puits (Brooks Life Science Systems, http://www.brooks.com) et recouverts de 150 L de 1,5% agarose à bas point de fusion contenant du TP (

35°C). Pour la coloration des mitochondries, les lignées CCP1 : Vénus et CCP2 : exprimant Vénus ont été cultivées dans un milieu liquide T-P avec de la paromomycine (2 g/mL) à une concentration de 2 à 4 × 10 6 cellules/mL. Les cultures ont été incubées avec MitoTracker Red CMXRos (Thermo Fisher Scientific) à une concentration finale de 1 m pendant 10 min, puis déposées sur une lame recouverte de polylysine pour l'imagerie. Les cellules ont été imagées à l'aide d'un microscope confocal adapté sur mesure (Leica DMI6000) avec des réglages à 514 nm/532-555 nm pour Vénus, 561 nm/573-637 nm pour la coloration par Mitotracker Red CMXRos et 561 nm/665-705 nm pour l'autofluorescence de la chlorophylle . Les images ont été analysées à l'aide du logiciel Fiji (http://fiji.sc/Fiji).

Analyses statistiques

Les variations de réponse entre les génotypes ont été évaluées soit par une analyse de variance (ANOVA) soit par la méthode de Student. t-tests suivis du test post hoc de différence significative honnête (HSD) de Tukey (SPSS Statistics 18, http://www.ibm.com/). Différences pour lesquelles P < 0,05 sont considérés comme significatifs.


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Conclusion

Here, we identified 92 COMT genes from blueberry and 425 COMT genes from 15 other species. According to phylogenetic analysis of COMTs, we divided the COMTs into two groups, which indicated the existence of two ancestor genes. DSD and WGD were revealed to be the major forces of blueberry evolution. The Ka/Ks ratios of the gene duplication patterns for the COMTs from the four plant species were less than 1, indicating that the COMTs have experienced strong purifying selection. According to the qRT-PCR results for 22 VcCOMTs, VcCOMT40, VcCOMT92 were highly expressed and may play important roles in the synthesis of lignin of blueberry fruit. The results of this study will build foundations for breeding blueberry cultivars with higher fruit firmness and longer shelf life.


We acknowledge funding of this research project by the Research Council of Norway (RCN) and the University of Hamburg (Hamburg, Germany). We are grateful to Prof. C. Benning (Michigan State University, East Lansing, United States) for providing the expression vector pNoc ox Venus. We also would like to thank Elke Wölken (Department of Aquatic Ecophysiology and Phycology, University of Hamburg) for analyses of immunogold-labeled N. oceanica transformants by transmission electron microscopy.

aa, amino acid ALNS, allantoin synthase ASW, artificial sea water At, Arabidopsis thaliana CaMV, cauliflower mosaic virus DC, decarboxylase DECR, 2,4-dienoyl-CoA reductase DHNS, 1,4-dihydroxy-2-naphthoyl-CoA synthase dpt, days post transformation EMB8, embryogenesis-associated protein 8 EPA, eicosapentaenoic acid EYFP/GFP, enhanced yellow/green fluorescent protein HIT, histidine triad family protein HIUase, 5-hydroxyisourate hydrolase IndA, indigoidine synthase A MDH, malate dehydrogenase MLS, malate synthase Ng, Nannochloropsis gaditana OHCU, 2-oxo-4-hydroxy-4-carboxy-5-ureidoimidazoline PEX, peroxin PfkB, 6-phosphofructokinase PGL3, 6-phosphogluconolactonase 3 PKT, peroxisomal 3-ketoacyl thiolase PTS1/2, peroxisomal targeting signal type 1/2 PUFA, polyunsaturated fatty acid PUKI, pseudouridine kinase PUMY, pseudouridine monophosphate glycosylase TEM, transmission electron microscopy.


Résultats

Proteome profile changes in P. patens under ABA treatment

Changes in the proteome profile between control and ABA treated plants suggested that exogenous ABA could trigger one or more responses in P. patens. In order to ensure statistically results, the experiments were carried out in triplicate. After CBB R-250 staining, more than 1,300 protein spots could be detected for each sample. Representative gels from control and ABA-treated plants and proteins showing altered abundance are presented in Figure ​ Figure1. 1 . Two-dimensional images were analyzed using ImageMaster™ 2D Platinum software. The volume percentage of each spot was estimated and compared across the gels. In the samples following ABA treatment, we repeatedly analyzed 89 protein spots, whose relative abundance was at least 1.5-fold different from the control. The proteins associated with 65 of these protein spots were subsequently identified using LC-MS/MS. Among them, 13 protein spots (D1-D13) were down-regulated, 52 protein spots (U1-U52) were up-regulated by ABA treatment including four protein spots (U22, U24, U40, U43) which were only present in the ABA-treated samples (Figure ​ (Figure1). 1 ). Quantitative analysis indicated that the abundance of these proteins changed [see Additional File 1: Supplemental Table S1] in response to ABA treatment (Figure ​ (Figure2) 2 ) suggesting that different physiological and biochemical processes are modified following ABA treatment.


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