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Comment les îlots CpG restent-ils non méthylés ?


Dans la plupart du génome, les sites CpG sont pratiquement toujours méthylés, mais les îlots CpG sont plutôt souvent non méthylés. Cela a été lié au fait qu'ils sont souvent associés à des gènes transcrits.

Quelles sont les théories actuelles sur les mécanismes impliqués dans cette déméthylation préférentielle ?


La méthylation est de plus en plus considérée comme une conséquence de l'activité des gènes plutôt que comme un mécanisme de régulation. Il y a des cas où la méthylation est contrôlée car du contrôle de la régulation des gènes, notamment au niveau du célèbre locus H19/Igf2[1]. Voici une critique récente généralement bonne[2], notez qu'ils mentionnent que la méthylation de l'ADN ne provoque pas de silence transcriptionnel, et les promoteurs probablement méthylés sont probablement Suite actifs que non méthylés, ils créent simplement des ARN de silençage lorsqu'ils sont méthylés (entraînant un silençage apparent). Cela peut aider à expliquer une partie de l'histoire[3], mais notez l'âge de ce papier, mais en général, je dirais que peu de gens connaissent son existence.

L'exception semble être les éléments transposables[4], mais leur contrôle est probablement également contrôlé par le silençage des ARN.

Les références:

  1. Zampieri M, Guastafierro T, Calabrese R, Ciccarone F, Bacalini MG, Reale A, Perilli M, Passananti C, Caiafa P. 2012. Les polymères ADP-ribose localisés sur le complexe Ctcf-Parp1-Dnmt1 empêchent la méthylation des sites cibles Ctcf. Le journal biochimique 441 : 645-52.

  2. Deaton AM, Oiseau A. 2011. Les îlots CpG et la régulation de la transcription. Gènes et développement 25 : 1010-22.

  3. Rountree MR, Selker UE. 1997. La méthylation de l'ADN inhibe l'élongation mais pas l'initiation de la transcription chez Neurospora crassa. Gènes et développement 11 : 2383-2395.

  4. Bourc'his D, Bestor TH. 2004. Catastrophe méiotique et réactivation du rétrotransposon dans les cellules germinales mâles dépourvues de Dnmt3L. Nature 431 : 96-9.


Les gènes humains avec des promoteurs insulaires CpG ont une organisation distincte de la chromatine associée à la transcription

Plus de 50 % des gènes humains initient la transcription à partir de régions riches en dinucléotides CpG appelées îlots CpG. Ces gènes présentent des différences dans leurs modèles d'initiation de la transcription et ont été signalés comme ayant des niveaux plus élevés de certaines modifications de la chromatine associées à l'activation.

Résultats

Nous rapportons ici que les gènes avec des promoteurs insulaires CpG ont une organisation caractéristique de la chromatine associée à la transcription. Cette signature comprend des niveaux élevés de modifications des histones associées à l'élongation de la transcription H4K20me1, H2BK5me1 et H3K79me1/2/3 à l'extrémité 5' du gène, l'épuisement des marques d'activation H2AK5ac, H3K14ac et H3K23ac immédiatement en aval du site de démarrage de la transcription (TSS ), et des asymétries épigénétiques caractéristiques autour du TSS. Le facteur d'organisation chromosomique CTCF peut être lié en amont de l'ARN polymérase dans la plupart des promoteurs d'îlots CpG actifs, et un nucléosome instable au niveau du TSS peut être spécifiquement marqué par H4K20me3, le premier exemple d'une telle modification. La monométhylation de H3K36 n'est détectée que enrichie dans les corps de gènes actifs qui ont des promoteurs d'îlots CpG. Enfin, à mesure que les niveaux d'expression augmentent, les niveaux de modification de pointe des méthylations des histones H3K9me1, H3K4me1, H3K4me2 et H3K27me1 s'éloignent davantage du TSS vers le corps du gène.

Conclusion

Ces résultats suggèrent que les gènes actifs avec des promoteurs insulaires CpG ont une série distincte en étapes de nucléosomes modifiés après le TSS. L'identité, le positionnement, la forme et l'ordre relatif des modifications d'histones associées à la transcription diffèrent entre les gènes avec et sans promoteurs insulaires CpG. Cela prend en charge un modèle où l'organisation de la chromatine reflète non seulement l'activité de transcription mais aussi le type de promoteur dans lequel la transcription s'initie.


Résumé

La méthylation de l'ADN est fréquemment décrite comme une marque épigénétique de « silence », et en effet, cette fonction de la 5-méthylcytosine a été initialement proposée dans les années 1970. Désormais, grâce à une cartographie améliorée de la méthylation à l'échelle du génome, nous pouvons évaluer la méthylation de l'ADN dans différents contextes génomiques : sites de démarrage de la transcription avec ou sans îlots CpG, dans les corps des gènes, au niveau des éléments régulateurs et des séquences répétées. L'image émergente est que la fonction de la méthylation de l'ADN semble varier selon le contexte, et la relation entre la méthylation de l'ADN et la transcription est plus nuancée que nous ne le pensions au début. Améliorer notre compréhension des fonctions de méthylation de l'ADN est nécessaire pour interpréter les changements de cette marque qui sont observés dans des maladies telles que le cancer.


Les protéines TET et les fonctions putatives de 5hmC

Les membres de la famille des protéines TET - TET1, TET2 et TET3 - sont des dioxygénases dépendantes du 2-oxoglutarate et du Fe(II) qui ont toutes la capacité de convertir 5mC en 5hmC in vitro et in vivo (Fig 1A Ito et al, 2010 Ko et al, 2010 Tahitien et al, 2009 ). En plus de la sous-unité catalytique de liaison au fer conservée, TET1 et TET3 ont également un domaine CXXC. Ce domaine de liaison à l'ADN a déjà été décrit comme un motif de liaison CpG, qui pourrait être impliqué dans le recrutement de TET1 et TET3 à l'ADN. Les protéines TET présentent une expression différentielle spécifique au tissu, TET1 étant principalement exprimée dans les CES, tandis que TET2 et TET3 sont exprimées de manière plus ubiquitaire (Szwagierczak et al, 2010 Tahitien et al, 2009 ).

Fait intéressant, alors que les niveaux de 5mC sont relativement constants, les intensités de 5hmC varient considérablement entre les tissus, les niveaux les plus élevés étant signalés pour des types de cellules spécifiques du cerveau (Globisch et al, 2010 Kriaucionis & Heintz, 2009 ). Les CES ont également des niveaux relativement élevés de 5hmC, qui diminuent au cours de la différenciation ( Globisch et al, 2010 Ko et al, 2011 Szwagierczak et al, 2010 Tahitien et al, 2009 ).

Plusieurs fonctions biologiques de la conversion médiée par TET de 5mC en 5hmC peuvent être envisagées (Fig 1B). Le fait que de novo L'activité de la méthyltransférase est faible dans les tissus différenciés, combinée à l'observation que la 5hmC se trouve à des niveaux relativement élevés dans certains tissus, suggère que la 5hmC dans certains tissus a un faible renouvellement. Dans ces situations, 5hmC pourrait fonctionner en modifiant l'environnement local de la chromatine par le recrutement ou le déplacement de protéines. Favorisant ce modèle, il a été rapporté que la plupart des protéines liant 5mC ne reconnaissent pas 5hmC ( Jin et al, 2010 Valinluck et al, 2004) et se dissocient ainsi vraisemblablement de l'ADN lorsque 5mC est converti en 5hmC. Cependant, il est également évident que la génération de 5hmC pourrait être impliquée dans la déméthylation de l'ADN. Premièrement, cela pourrait se faire par un mécanisme passif dans lequel la marque, contrairement à 5mC, ne serait pas maintenue par la réplication de l'ADN. La déméthylation passive de l'ADN serait particulièrement pertinente dans les cellules à division rapide telles que les CES. Le fait que les cellules cérébrales, qui ne se divisent pas rapidement, aient des niveaux élevés de 5hmC, soutient ce modèle. De plus, il a été démontré que le DNMT1 méthyle l'ADN contenant 5hmC avec une efficacité inférieure à l'ADN hémiméthylé 5mC (Valinluck & Sowers, 2007).

Deuxièmement, la production de 5hmC pourrait être un intermédiaire dans une voie de déméthylation active qui remplace finalement 5mC par de la cytosine dans les cellules qui ne se divisent pas. Il a été proposé d'impliquer des mécanismes de réparation de l'ADN spécifiques tels que la désamination médiée par la famille AID/APOBEC de cytidine désaminases, la conversion de hmC en hmU suivie d'une réparation par excision de base (BER) ou d'une glycosylation 5hmC suivie de BER (examiné dans Guo et al, 2011 ). De plus, l'hypothèse selon laquelle la génération de 5hmC est un intermédiaire dans une voie enzymatique de déméthylation active a été récemment étayée par des études démontrant l'existence de formylcytosine et de carboxylcytosine dans l'ADN de mammifère (Fig 1B He et al, 2011 et al, 2011 Pfaffeneder et al, 2011 ). Ces nouvelles modifications de cytosine peuvent être générées par deux réactions d'oxydation successives de 5hmC catalysées par les protéines TET ( He et al, 2011 et al, 2011 ), soulevant la possibilité que les protéines TET pourraient être impliquées dans plusieurs étapes de la conversion de 5mC en cytosine. Comme les protéines TET ne peuvent pas convertir la carboxylcytosine en cytosine, une décarboxylase ou une glycosylase pourraient être impliquées dans cette étape. En accord avec cela, l'épuisement de la thymidine-ADN glycosylase (TDG) conduit à l'accumulation de carboxylcytosine dans les CSE de souris ( He et al, 2011 ), et d'autres études ont montré que le TDG est nécessaire pour la déméthylation de l'ADN ( Cortellino et al, 2011 ).


Résultats et discussion

ZBTB2 se lie aux promoteurs actifs des îlots CpG dans les cellules souches embryonnaires de souris in vivo

Pour déterminer l'ensemble du génome in vivo Sites de liaison à l'ADN du lecteur d'ADN non méthylé putatif ZBTB2, nous avons effectué une immunoprécipitation de la chromatine suivie d'un séquençage en profondeur (ChIP-seq). À cette fin, nous avons généré une lignée ESC de souris avec un transgène de chromosome artificiel bactérien (BAC) intégré de manière stable codant pour le Zbtb2 gène fusionné à une étiquette de protéine fluorescente verte (GFP) C-terminale sous le contrôle de son promoteur endogène 15 . Grâce à l'analyse ChIP-seq avec un anticorps contre la GFP, nous avons identifié ± 4 000 sites de liaison à ZBTB2 dans les CES. La localisation génomique de ces pics a révélé que la majorité des sites de liaison à ZBTB2 (81 %) est située à moins de 5 kb d'un site de début de transcription (TSS) (Fig 1A). Une analyse plus détaillée de la distribution génomique de ces pics a confirmé la liaison préférentielle de ZBTB2 aux TSS et, en outre, a montré que la plupart de ces TSS contiennent un îlot CpG (CGI) (Fig 1B). L'analyse d'enrichissement de motifs a montré qu'un motif de liaison à ZBTB2 récemment rapporté 16 ne s'est pas avéré être enrichi dans nos pics de ZBTB2 dans les CES par rapport à tous les CGI (Fig EV1C), suggérant que in vitro et in vivo les sites de liaison peuvent différer. En outre, de novo Les recherches de motifs dans notre ensemble de données ChIP-seq n'ont identifié aucun motif de consensus clair pour la liaison de ZBTB2, mais ont indiqué qu'un ou plusieurs dinucléotides CpG sont généralement présents. Pour étayer cette découverte, nous avons comparé le nombre de dinucléotides CpG sur les sites de liaison de ZBTB2 à un ensemble de promoteurs aléatoires de la même longueur moyenne et avons constaté que les pics de ZBTB2 contiennent en effet significativement plus de CpG (Fig EV1D). Cependant, tous les TSS ou même les CGI ne sont pas liés par ZBTB2, ce qui suggère que les dinucléotides CpG sont importants mais pas suffisants pour le recrutement de ZBTB2 (Figs 1C et EV1E). Afin d'identifier d'autres facteurs qui déterminent la liaison de ZBTB2, nous avons examiné si les pics de ZBTB2 sont enrichis pour des marques d'histone particulières. Cette analyse a révélé que ZBTB2 interagit principalement avec les TSS et les CGI marqués par H3K4me3 et H3K27ac. Étant donné que ces marques d'histones sont associées aux promoteurs actifs 17 18 (Figs 1C et EV1E), nos données démontrent ainsi que ZBTB2 se lie préférentiellement aux promoteurs actifs des îlots CpG dans les CES. in vivo.

Figure 1. Localisation génomique de ZBTB2 dans des cellules souches embryonnaires de souris in vivo

  1. Histogramme représentant la localisation génomique par rapport à un TSS des pics appelés ZBTB2 ChIP-seq dans les CES.
  2. Distribution génomique des pics appelés ZBTB2 ChIP-seq dans les CES.
  3. Carte thermique montrant la densité de lecture ChIP-seq (normalisée sur RPKM) pour ZBTB2, H3K4me3 43 et H3K27ac 44 dans les ESC, centrée sur tous les TSS de souris.

Anticorrélation de la dynamique de liaison ZBTB2 avec la méthylation différentielle de l'ADN in vivo

Étant donné que la plupart des CGI sont hypométhylés 4 , notre conclusion selon laquelle la liaison de ZBTB2 est enrichie au niveau des CGI in vivo est conforme au fait que ZBTB2 est un lecteur d'ADN non méthylé. Examiner si l'occupation de ZBTB2 est influencée par la méthylation de l'ADN in vivo, nous avons modifié les niveaux mondiaux de méthylation de l'ADN de deux manières. Tout d'abord, nous avons induit une hypométhylation globale de l'ADN dans les CES BAC ZBTB2-GFP en ajoutant deux inhibiteurs de kinase à petites molécules ciblant MEK et GSK3β au milieu de culture (2i) 19. Deuxièmement, nous avons différencié les ESC ZBTB2-GFP BAC en cellules progénitrices neurales (NPC), modifiant ainsi le paysage de la méthylation de l'ADN d'une manière spécifique au type cellulaire 20 . Les analyses ChIP-seq sur ces lignées cellulaires ont révélé que la liaison de ZBTB2 à l'échelle du génome augmente après l'ajout de 2i et diminue lors de la différenciation en PNJ (Fig 2A). Il est important de noter que les niveaux de protéines ZBTB2 restent dans la même plage pour toutes ces conditions (Fig EV2A et B), même si les niveaux d'ARNm semblent être plus variables lors de l'ajout de 2i (Fig EV2C), indiquant que ces dynamiques de liaison ne sont pas uniquement causées par des changements en quantité. Pour étudier dans quelle mesure la dynamique observée dans la liaison de ZBTB2 est liée aux changements dans la méthylation de l'ADN, nous avons utilisé des profils de méthylation accessibles au public à partir de CSE cultivées dans du sérum/LIF ou dans des conditions 2i complètes 21 ou des CSE et des PNJ 20 comme proxy pour le génome- de larges niveaux de méthylation de l'ADN dans nos lignées cellulaires. Nous avons pris l'union de tous les pics ZBTB2 qui ont été appelés dans l'une ou l'autre de nos expériences ChIP-seq, les avons regroupés en fonction de leur annotation génomique, puis avons comparé la différence de méthylation de l'ADN telle que prédite par les profils de méthylation au changement de pli dans la liaison de ZBTB2 tel que déterminé par ChIP-seq (Fig EV2D et E). Ces analyses suggèrent qu'en moyenne, les sites où se produisent le plus de dynamique de liaison à ZBTB2 présentent également le plus grand changement dans la méthylation de l'ADN. Pour valider ces résultats, nous avons sélectionné quelques loci contenant un CGI et effectué une ChIP-qPCR et une immunoprécipitation d'ADN méthylé (MeDIP)-qPCR pour mesurer respectivement les niveaux de ZBTB2 et de méthylation de l'ADN (Figs 2B et C, et EV2F et G). Également dans nos lignées cellulaires, nous avons observé une anticorrélation entre la liaison de ZBTB2 d'une part et la méthylation de l'ADN d'autre part, suggérant que la dynamique de liaison de ZBTB2 in vivo sont sensibles à la méthylation différentielle de l'ADN.

Figure 2. Comparaison de l'occupation de ZBTB2 et de la méthylation différentielle de l'ADN in vivo

  • A. Carte thermique montrant la densité de lecture ChIP-seq (normalisée sur RPKM) pour ZBTB2 dans ZBTB2-GFP BAC ESC cultivés dans des conditions sérum/LIF (milieu) ou sérum/LIF + 2i conditions (gauche), et dans ZBTB2-GFP BAC PNJ (à droite), centrés sur l'union des pics ZBTB2 dans ces trois conditions.
  • B, C. Comparaisons de l'occupation de ZBTB2 (évaluées par ChIP-qPCR) et des niveaux de méthylation de l'ADN (mesurés par MeDIP-qPCR) à trois loci (voir Fig EV2F et G), entre les CES du BAC ZBTB2-GFP dans le sérum/LIF et le sérum/ Conditions LIF + 2i (B) ou entre ZBTB2-GFP BAC ESC et NPC (C). Les données sont représentées sous forme de moyenne ± SEM de trois réplicats biologiques (P = tel que déterminé par Welch t-test).

Figure EV2. Comparaison de l'occupation de ZBTB2 et de la méthylation différentielle de l'ADN (liée à la figure 2)

  • A, B. Analyses Western blot des niveaux de ZBTB2 endogènes et marqués GFP dans les CES ZBTB2-GFP BAC dans des conditions sérum/LIF ou sérum/LIF + 2i (A) ou ZBTB2-GFP BAC ou NPC (B). L'histone H3 a été utilisé comme témoin de charge. NE = extrait nucléaire (fraction soluble nucléaire), NP = culot nucléaire (fraction liée à la chromatine).
  • C. Analyse qRT–PCR de Zbtb2 niveaux dans les ESC ZBTB2-GFP BAC cultivés sans ou avec 2i. Les données sont représentées sous forme de moyenne ± SEM de trois réplicats biologiques (*P = 0,02, gallois t-test).
  • D, E. Comparaison de la dynamique de liaison de ZBTB2 et de la méthylation différentielle de l'ADN 2021 à l'union des pics de ZBTB2 qui ont été appelés dans nos trois expériences ChIP-seq, présentées comme les valeurs moyennes pour chaque catégorie génomique. Dynamique de liaison ZBTB2 (tracée sur le X-axis) sont calculés comme le facteur de changement dans les valeurs de RPKM obtenues à partir de ZBTB2-GFP ChIP-seq dans +2i par rapport aux conditions sérum/LIF (D), ou dans les NPC par rapport aux ESC (E). Méthylation différentielle de l'ADN (tracée sur le oui-axis) est la différence de statut de méthylation moyen entre +2i et sérum/LIF (D) ou NPC et ESC (E).
  • F, G. Vues du navigateur génomique de l'UCSC des régions génomiques qui ont été utilisées pour l'analyse spécifique au locus de la liaison de ZBTB2 et de la méthylation de l'ADN (Fig. 2B et C). Tous les loci, à l'exception du locus de contrôle négatif, contiennent un CGI. Les amorces qPCR (tableau en annexe S5) ont été conçues pour amplifier une région de 100 à 200 pb dans les lignes en pointillés. BS-seq = séquençage au bisulfite 2145 .

Les données sources sont disponibles en ligne pour cette figure.

ZBTB2 recrute un module à doigt de zinc pour l'ADN non méthylé

Nous avons ensuite joué in vitro des tests de liaison pour élucider davantage les mécanismes derrière la liaison de ZBTB2 à l'ADN. À cette fin, nous avons sélectionné un locus contenant un CGI sur le génome de la souris où nous avons observé une forte anticorrélation entre l'occupation de ZBTB2 et la méthylation de l'ADN dans les CES par rapport aux PNJ, tandis que les données d'hypersensibilité à la DNase I suggèrent que cette région génomique est accessible dans les deux types de cellules. in vivo (Figures 3A et EV3A). Pour tester si les propriétés de liaison à l'ADN de ZBTB2 changent lors de la différenciation en un type de cellule différent, nous avons effectué des extractions d'ADN avec cette séquence génomique contenant des CpG non méthylés ou méthylés, et en utilisant des extraits de protéines nucléaires d'ESC ou de NPC. Ces expériences ont révélé que in vitro, ZBTB2 est capable de se lier à la séquence non méthylée indépendamment de l'origine de l'extrait protéique, ce qui suggère que la capacité inhérente de ZBTB2 à se lier à l'ADN non méthylé n'est pas altérée dans les PNJ (Figs 3B et C et EV3B). Nous avons ensuite étudié la possibilité que ZBTB2 interagisse avec différentes protéines dans les CES et les PNJ, ce qui pourrait également affecter son recrutement dans l'ADN. Par conséquent, nous avons préparé des extraits de protéines nucléaires de ZBTB2-GFP BAC ESC et NPC et effectué des pull-downs GFP pour identifier les partenaires d'interaction ZBTB2. Ces expériences ont démontré que ZBTB2 interagit avec deux autres protéines à doigt de zinc, ZBTB25 et ZNF639, dans les deux types cellulaires (Fig. 3D et E). Nous avons validé ces interactions protéine-protéine dans les CSE par des pull-downs réciproques et une analyse Western blot (Fig EV3C-E). Alors que les partenaires d'interaction de ZBTB2 ne changent donc pas au cours de la différenciation, les protéines à doigt de zinc sont connues pour avoir la capacité de se lier à l'ADN 22, donnant lieu à la possibilité que le recrutement de ZBTB2 à l'ADN soit médié par l'un ou les deux de ses partenaires d'interaction. Nous avons ensuite examiné si ZBTB2 conserverait sa capacité de liaison à l'ADN en l'absence de ZBTB25 et ZNF639. À cette fin, nous avons produit la protéine ZBTB2 recombinante fusionnée à la GST dans Escherichia coli et utilisé ceci pour les pull-downs d'ADN avec des sondes d'ADN génériques non méthylées et méthylées 7 . L'analyse par Western blot a révélé que la ZBTB2 recombinante se lie à la sonde non méthylée avec une affinité élevée, alors que presque aucune liaison ne peut être observée à la sonde méthylée (figure 3F). Un résultat similaire a été obtenu lorsque la région génomique indiquée sur la figure 3A a été utilisée (figure EV3F). Cela confirme nos découvertes selon lesquelles ZBTB2 se lie préférentiellement à l'ADN non méthylé et montre que cette liaison est directe et indépendante de son interaction avec ZBTB25 ou ZNF639. En revanche, lorsque nous avons répété l'extraction de l'ADN avec la région génomique que nous avons décrite ci-dessus en utilisant un extrait de protéine nucléaire de Zbtb2 ESC knockout (KO), nous avons constaté que ZBTB25 et ZNF639 ne sont plus capables de se lier à cette région (Fig EV3G). Bien que nous ne puissions pas exclure la possibilité que les niveaux de protéines de ZBTB25 et ZNF639 soient affectés lors du knock-out de ZBTB2, l'analyse RNA-seq comparant le type sauvage et Zbtb2 KO ESCs ne montre aucune différence significative dans les niveaux d'ARNm (Fig EV3H). Ainsi, nous concluons que ZBTB2 forme un module avec ZBTB25 et ZNF639 et que la capacité de ce module à se lier à l'ADN non méthylé dépend de ZBTB2.

Figure 3. ZBTB2 lit l'ADN non méthylé directement et indépendamment de ses partenaires d'interaction

  • A. Vue du navigateur du génome UCSC de la liaison ZBTB2, des données de séquençage du bisulfite 45 et des pistes d'hypersensibilité à la DNase I 46 dans les CES et les PNJ. La région qui a été utilisée pour les extractions d'ADN est située à l'intérieur des lignes en pointillés.
  • B, C. Nuages ​​de points de pull-downs d'ADN avec la région génomique indiquée en (A), en utilisant un extrait de protéine nucléaire de CES de type sauvage (B) ou de PNJ (C). Les protéines se liant spécifiquement à la séquence non méthylée ou méthylée sont représentées respectivement dans le quadrant inférieur gauche ou supérieur droit. Les valeurs aberrantes significatives ont été déterminées à l'aide de statistiques en boîte à moustaches. En (C), ZBTB2 et ZNF639 étaient juste en dessous des seuils statistiques et ont été indiqués en rouge foncé. Tous les pull-downs ont été effectués en double et comprenaient un échange d'étiquettes. Boîte : médiane (ligne centrale), premier et troisième quartile (limites de la boîte) moustaches : 1,5 × intervalle interquartile.
  • D, E. Volcano plots de pull-downs GFP sans étiquette utilisant des extraits nucléaires de ZBTB2-GFP BAC ESCs (D) ou NPCs (E). L'intensité de la quantification sans étiquette (LFQ) de l'expérience par rapport au contrôle [fold change (FC)] est tracée sur le X-axe corrigé par FDR t-les valeurs de test sont tracées sur le oui-axe. Les lignes grises indiquent les seuils statistiques. Tous les pull-downs ont été effectués en triple.
  • F. Analyse par transfert Western de pull-downs d'ADN en utilisant des sondes d'ADN génériques non méthylées ou méthylées avec une GST-ZBTB2 recombinante non purifiée (panneau supérieur) ou purifiée par GST (panneau inférieur) GST-ZBTB2. La fraction liée est constituée de protéines qui se sont liées aux sondes d'ADN et la fraction non liée représente 5 % du surnageant restant.

Les données sources sont disponibles en ligne pour cette figure.

Figure EV3. ZBTB2 lit l'ADN non méthylé directement et indépendamment de ses partenaires d'interaction (lié à la figure 3 )

  1. Comparaison de l'occupation de ZBTB2 (évaluée par ChIP-qPCR) et des niveaux de méthylation de l'ADN (mesurés par MeDIP-qPCR) entre ZBTB2-GFP BAC ESC et NPC, au locus génomique représenté sur la figure 3A. Les données sont représentées sous forme de moyenne ± SEM de trois réplicats biologiques (P = tel que déterminé par Welch t-test).
  2. Validation par transfert Western des pull-downs d'ADN représentés sur les figures 3B et C. La fraction liée se compose de protéines qui se sont liées aux sondes d'ADN, et la fraction non liée représente 5 % du surnageant restant.
  3. Validation par Western blot des pull-downs GFP représentés sur la figure 3D. Le pull-down GFP sur ZBTB2-GFP donne la GFP-tagged (bande supérieure) ainsi que la protéine endogène (bande inférieure).
  4. Analyse par transfert Western de pull-downs ZBTB25 endogènes avec un extrait de protéine nucléaire ESC de type sauvage. Des pull-downs avec IgG sont utilisés comme contrôle.
  5. Analyse par transfert Western des pull-downs FLAG avec un extrait de protéine nucléaire de CES transfectées de manière transitoire avec une construction ZNF639-FLAG. Des pull-downs FLAG avec un extrait nucléaire ESC de type sauvage sont utilisés comme contrôle.
  6. Analyse par transfert Western des pull-downs d'ADN en utilisant la région génomique non méthylée ou méthylée indiquée sur la figure 3A avec la GST-ZBTB2 recombinante non purifiée (panneau supérieur) ou purifiée par GST (panneau inférieur). La fraction liée est constituée de protéines qui se sont liées aux sondes d'ADN et la fraction non liée représente 5 % du surnageant restant.
  7. Nuage de points des pull-downs d'ADN avec la région génomique indiquée dans la figure 3A, en utilisant l'extrait de protéine nucléaire de Zbtb2 ESC KO. Tous les pull-downs ont été effectués en double et comprenaient un échange d'étiquettes. Boîte : médiane (ligne centrale), premier et troisième quartile (limites de la boîte) moustaches : 1,5 × intervalle interquartile.
  8. Analyse RNA-seq de Zbtb25 et Znf639 niveaux dans Zbtb2 KO ESCs, par rapport aux ESCs de type sauvage. Les données sont représentées comme la moyenne de deux répétitions biologiques.

Les données sources sont disponibles en ligne pour cette figure.

La liaison et l'expression de ZBTB2 et la méthylation de l'ADN sont étroitement liées

Alors que les résultats précédents suggèrent que la méthylation de l'ADN peut influencer la liaison de ZBTB2, nous nous sommes demandé si les niveaux de ZBTB2 peuvent à l'inverse également affecter les niveaux de méthylation de l'ADN. Pour étudier cela, nous avons mesuré les niveaux mondiaux de meC et de hmC dans les CES de type sauvage, Zbtb2 ESC KO et ESC ZBTB2-GFP BAC. Nous avons constaté que les niveaux mondiaux de meC sont plus faibles dans Zbtb2 KO ESC et plus dans les ESC ZBTB2-GFP BAC par rapport aux ESC de type sauvage, tandis que l'inverse est vrai pour les niveaux globaux de hmC (Fig 4A). Pour mieux comprendre le mécanisme sous-jacent de cet effet, nous avons examiné nos données RNA-seq comparant le type sauvage et Zbtb2 KO ESC si l'expression de tout régulateur connu de la méthylation ou de la déméthylation de l'ADN est modifiée dans Zbtb2 KO ESCs par rapport aux cellules de type sauvage. En effet, nous avons trouvé les ADN méthyltransférases Dnmt3A, Dnmt3B et Dnmt3L, ainsi que les déméthylases Tet1 et Tet2, à exprimer différentiellement en Zbtb2 KO ESC (Fig EV4A). Ensemble, cela suggère que le réseau de méthylation de l'ADN est amélioré dans Zbtb2 KO ESC, entraînant un renouvellement plus élevé de l'ADN méthylé. Nous avons validé ces résultats par qRT-PCR dans le type sauvage et Zbtb2 KO ESCs et a également montré que les niveaux d'expression peuvent être restaurés vers des niveaux de type sauvage dans une surexpression transitoire de ZBTB2 dans le Zbtb2 Ligne KO (Fig 4B). En outre, nous avons constaté que les changements dans les niveaux d'expression de TET1 se reflètent dans son occupation au niveau des îlots CpG (Fig EV4B), suggérant un rôle actif de ZBTB2 dans la régulation des niveaux de meC et de hmC dans les CGI. Compte tenu de nos découvertes précédentes selon lesquelles la liaison de ZBTB2 est sensible à la méthylation de l'ADN, cela est particulièrement intéressant, car cela suggère que ZBTB2 est impliqué dans une boucle de rétroaction pour réguler son propre recrutement à l'ADN. Nous supposons donc que la liaison de ZBTB2 aux promoteurs CGI non méthylés est régulée par une interaction complexe entre les niveaux de méthylation de l'ADN et l'expression des ADN méthylases et déméthylases, dans laquelle ZBTB2 lui-même joue un rôle clé.

Figure 4. Effet de ZBTB2 sur les niveaux de méthylation de l'ADN à l'échelle du génome

  1. Niveaux globaux de meC et de hmC dans le type sauvage, Zbtb2 Knockout et ZBTB2-GFP BAC ESC. Les données sont représentées sous forme de moyenne ± SEM de cinq réplicats biologiques (*P = 0.01857, **P = 0.003181, ***P = 0,0007674, n.s. = non significatif, gallois t-test).
  2. Analyse qRT-PCR des niveaux d'expression génique dans le type sauvage, Zbtb2 KO (KO) et Zbtb2 KO ESCs transfectés transitoirement avec ZBTB2 [Zbtb2 sauvetage (RC)]. Les données sont représentées sous forme de moyenne ± SEM de trois réplicats biologiques (*P < 0.05 par rapport à WT, Welch t-test).

Figure EV4. Effet de ZBTB2 sur l'abondance des ADN (dé)méthylases et l'occupation de TET1 (lié à la figure 4 )

  1. Analyse RNA-seq des niveaux d'expression génique dans Zbtb2 KO ESCs, par rapport aux ESCs de type sauvage. Les données sont représentées comme la moyenne de deux répétitions biologiques.
  2. Analyse ChIP-qPCR de la liaison de TET1 sur des îlots CpG sélectionnés dans le type sauvage, Zbtb2 KO (KO) et Zbtb2 KO ESCs transfectés de manière transitoire avec ZBTB2 [Zbtb2 sauvetage (RC)]. Les données sont représentées sous forme de moyenne ± SEM de trois réplicats biologiques (P > 0,05 pour toutes les comparaisons par paires, Welch t-test).

ZBTB2 est un activateur de gènes et régule la sortie de la pluripotence

Pour explorer la signification biologique de l'occupation de ZBTB2 au niveau des promoteurs CGI non méthylés dans les CES, nous avons analysé plus en profondeur nos données RNA-seq de type sauvage et Zbtb2 ESC KO. Étant donné que la méthylation de l'ADN a généralement été associée au silençage génique, nous nous attendions à ce que ZBTB2 agisse comme un activateur de gène plutôt que comme un répresseur. À l'appui de cette notion, nous avons constaté que dans Zbtb2 Les CES KO, ​​± 850 gènes sont régulées différemment par rapport aux CES de type sauvage, la majorité devenant régulées à la baisse. Pour déterminer si ces gènes exprimés de manière différentielle sont des gènes cibles directs de ZBTB2, nous avons intégré nos ensembles de données RNA-seq et ChIP-seq (Dataset EV2). Cela a abouti à l'identification de ± 300 gènes qui sont liés par ZBTB2 dans les CSE de type sauvage et dont l'expression est significativement modifiée dans Zbtb2 KO ESCs, suggérant que ZBTB2 régule directement l'expression de ces gènes (Fig 5A). La majorité de ces gènes directement régulés sont régulés négativement dans Zbtb2 KO par rapport aux CES de type sauvage. De plus, lorsque l'on compare le rapport des gènes exprimés aux gènes silencieux dans le sous-ensemble de gènes liés à ZBTB2 à l'ensemble du transcriptome, tel que déterminé par RNA-seq dans les CSE de type sauvage, nous avons constaté que ce rapport est significativement plus élevé pour les gènes liés à ZBTB2 ( figure EV5A). Dans l'ensemble, ces résultats proposent un rôle pour ZBTB2 en tant qu'activateur de gène, cohérent avec notre compréhension de la méthylation de l'ADN en tant que marque épigénétique répressive.

Figure 5. ZBTB2 agit comme un activateur de gènes et stimule la différenciation cellulaire

  1. Diagramme de Venn comparant les gènes liés par ZBTB2 dans les CES (identifiés par ChIP-seq, vert) et les gènes dont l'expression change de manière significative dans Zbtb2 KO ESCs (tels qu'identifiés par RNA-seq, orange).
  2. Les cinq principaux résultats de l'analyse d'enrichissement des termes GO des gènes identifiés en (A) pour être directement régulés par ZBTB2.
  3. Coloration à la phosphatase alcaline de type sauvage et Zbtb2 KO ESCs après culture pendant 5 jours en l'absence de LIF pour induire la différenciation. Les cellules qui ont été cultivées pendant 5 jours en présence de 2i ont servi de référence pour des cellules totalement indifférenciées. Les images sont représentatives de huit répliques biologiques. Barres d'échelle : 100 m.
  4. Analyse qRT-PCR des marqueurs de pluripotence et de différenciation dans les Zbtb2 KO ESCs après culture pendant 5 jours en l'absence de LIF. Les données sont représentées sous forme de moyenne ± SEM de trois réplicats biologiques (*P < 0.05, Gallois t-test).
  5. Modèle proposé de la dynamique de liaison ZBTB2. Dans les CES, ZBTB2 recrute un module à doigt de zinc pour les promoteurs d'îlots CpG non méthylés, régulant ainsi les gènes qui sont importants pour la différenciation. ZBTB2 influence sa propre liaison en régulant les enzymes TET et par conséquent le taux de déméthylation de l'ADN. Lors de la différenciation, la liaison du module doigt de zinc est réduite par l'augmentation des niveaux de méthylation de l'ADN.

Figure EV5. ZBTB2 agit comme un activateur de gènes et stimule la différenciation cellulaire (liée à la figure 5 )

  1. Pourcentages de gènes exprimés et non exprimés dans le transcriptome total des CSE de type sauvage et le sous-ensemble de gènes liés à ZBTB2 (*P = 8.348e-09, test exact de Fisher).
  2. Analyse RNA-seq des niveaux d'expression génique dans Zbtb2 KO ESCs, par rapport aux ESCs de type sauvage. Les données sont représentées comme la moyenne de deux répétitions biologiques.
  3. Analyses Western blot des taux de protéines dans les types sauvage et Zbtb2 ESC KO. L'histone H3 a été utilisé comme témoin de charge.
  4. Analyse qRT-PCR des niveaux d'expression génique dans le type sauvage, Zbtb2 KO (KO) et Zbtb2 KO ESCs transfectés transitoirement avec ZBTB2 [Zbtb2 sauvetage (RC)]. Les données sont représentées sous forme de moyenne ± SEM de trois réplicats biologiques (*P < 0.05 par rapport à WT, Welch t-test).

Les données sources sont disponibles en ligne pour cette figure.

Ensuite, nous avons effectué une analyse d'enrichissement à terme de l'ontologie génique (GO) sur les gènes qui sont directement régulés par ZBTB2 et avons constaté que l'un des processus auxquels ces gènes sont principalement associés est le développement embryonnaire (Fig 5B). Dans cette optique, nos données RNA-seq ont révélé qu'un certain nombre de facteurs de pluripotence (tels que ESRRB, KLF4 et NANOG) sont significativement régulés à la hausse dans Zbtb2 KO ESCs par rapport aux cellules de type sauvage (Fig EV5B), suggérant que le réseau de pluripotence dans Zbtb2 Les cellules KO sont perturbées. Nous l'avons validé par Western blot et qRT-PCR dans le type sauvage et Zbtb2 KO ESCs et a également montré qu'une surexpression transitoire de ZBTB2 dans le Zbtb2 La lignée KO entraîne une diminution des niveaux d'expression vers les niveaux de type sauvage (Fig. EV5C et D). Pour étudier si une expression plus élevée de ces facteurs de pluripotence induit une différenciation retardée dans Zbtb2 KO ESCs, nous avons induit la différenciation dans ces cellules en les cultivant en l'absence de LIF et évalué leur pluripotence par coloration à la phosphatase alcaline et qRT-PCR. Nous avons constaté qu'après 5 jours en milieu sans LIF, Zbtb2 Les CES KO présentent une morphologie moins différenciée par rapport aux cellules de type sauvage qui ont été traitées de manière égale (figure 5C). De plus, l'analyse qRT-PCR au cinquième jour après le retrait du LIF a montré que plusieurs facteurs de pluripotence restent plus fortement exprimés dans Zbtb2 KO ESCs par rapport aux cellules de type sauvage, tandis que l'inverse a été observé pour les fabricants de différenciation (Fig 5D). Ensemble, ces observations suggèrent que Zbtb2 Les ESC KO se différencient plus lentement et impliquent donc que ZBTB2 est impliqué dans la régulation des gènes qui sont importants pour la différenciation des ESC.

Remarques finales

Sur la base de nos résultats, nous proposons un modèle de dynamique de liaison de ZBTB2 (Fig 5E) dans lequel ZBTB2, avec ZBTB25 et ZNF639, se lie aux promoteurs d'îlots CpG non méthylés dans les CSE, ce qui est principalement corrélé positivement avec l'expression des gènes associés . ZBTB2 influence sa propre liaison en régulant les enzymes TET, qui catalysent la première étape de la déméthylation de l'ADN en convertissant le meC en hmC. ZBTB2 lui-même ne se lie pas aux promoteurs des TET, indiquant que cette régulation est probablement indirecte. Dans les cellules différenciées, l'augmentation des niveaux de méthylation entraîne une diminution de la liaison du module doigt de zinc.

While this model recapitulates the findings we presented in this study, further research is needed to gain a more complete picture of the biological mechanisms that regulate ZBTB2 binding in the genome and its function. Although we have demonstrated that ZBTB2 binding is sensitive to DNA methylation, DNA methylation dynamics at dynamic ZBTB2-binding sites are not always very pronounced, suggesting that there may be mechanisms other than DNA methylation that can regulate ZBTB2 binding to genomic loci. Furthermore, it remains to be resolved why ESCs show a delay in differentiation upon Zbtbt2 knockout. The genes that are directly regulated by ZBTB2 include some well-known pluripotency factors, such as Klf4, Tbx3, Tfcp2l1 et Nr5a2 23 24 . However, these genes are all among the subset of genes whose expression goes up rather than down in the Zbtb2 KO, raising the question through which exact mechanisms ZBTB2 regulates gene expression. Previous studies have identified interactions between ZBTB2 and co-activator or co-repressor complexes containing histone acetyltransferase or deacetyltransferase activity, respectively, leading to gene activation or gene repression 25 26 27 . In addition, ZBTB2 has been reported to interact with numerous other proteins, such as OCT4 and PTIP 28 29 . However, we could not confirm any of these interactions in our GFP-ZBTB2 interaction proteomics data, suggesting that these interactions are either quite transient, substoichiometric or cell-type specific. Another putative mechanism of ZBTB2-regulated gene expression is through inhibition of binding of other transcription factors. Indeed, ZBTB2 has been suggested to compete with Sp1 for binding to G/C box motifs and to prevent p53 binding through a direct protein–protein interaction 26 . Comprehensive and integrative analysis of various genomics data sets will enable us to investigate to what extent these observations are representative of a general phenomenon.


The chromatin signature of CGIs

Unstable nucleosomes

There is evidence that nonmethylated CGIs are organized in a characteristic chromatin structure that predisposes them toward promoter activity. A study of chromatin at LPS-inducible genes in macrophages found that CGIs are relatively nucleosome-deficient (Ramirez-Carrozzi et al. 2009). Inducible “primary response genes” fall into two classes: those that require SWI/SNF chromatin remodeling complexes for their activation and those that do not. It was noticed that these groups corresponded with non-CGI and CGI promoters, respectively, suggesting that DNA in CGI chromatin is intrinsically accessible without the need for ATP-dependent nucleosome displacement (Ramirez-Carrozzi et al. 2009). In macrophages, the CGIs showed a reduced density of histone H3 even in the uninduced state. Accordingly, in vitro nucleosome assembly indicated that a set of these CGIs is significantly more reluctant to assemble into nucleosomes than other genomic DNA (Ramirez-Carrozzi et al. 2009). An attractive interpretation of the in vitro instability of CGI chromatin is that weakening of this barrier allows greater accessibility of the underlying DNA to transcriptional regulators in vivo. Other evidence has shown that nucleosome deficiency is a feature of CGI promoters in general. Early analysis of CGI chromatin detected abundant nonnucleosomal DNA that was absent in preparations of bulk chromatin (Tazi and Bird 1990). The same conclusion emerged from a re-examination of genome-wide nucleosome mapping data (Schones et al. 2008 Choi 2010). In addition to chromatin instability, nucleosome deficiency in vivo may also arise because CGI promoters, in common with all eukaryotic promoters, typically possess a nucleosome-free region surrounding the TSS (Schones et al. 2008). In other words, active promoters by definition may be nucleosome-deficient whether or not they are CGIs. It is not yet certain whether nucleosome deficiency at CGIs is due primarily to intrinsic chromatin instability or nucleosome exclusion due to the presence of the transcription initiation complex. It could, of course, be a mixture of both, and may even vary between individual CGIs.

Characteristic histone modifications

Early biochemical studies of isolated CGI chromatin showed high levels of histone H3 and H4 acetylation, which are characteristic of transcriptionally active chromatin. Histone H1, on the other hand, which is regarded as antagonistic to transcription, was depleted in this fraction (Tazi and Bird 1990). Genome-wide studies have confirmed this association at high resolution (Birney et al. 2007 Wang et al. 2008) and have revealed that H3K4me3 is a signature histone mark of CGI promoters, often persisting even when the associated gene is inactive (Guenther et al. 2007 Mikkelsen et al. 2007). Recent work has established a biochemical connection between the abundance of CpG in CGIs and H3K4me3, mediated by a CXXC domain protein that binds specifically to nonmethylated CpG (Voo et al. 2000). Cfp1 (CXXC finger protein 1 also known as CGBP) is an integral component of the Setd1 H3K4 methyltransferase complex (Lee and Skalnik 2005) and localizes to the vast majority of CGIs in the mouse genome, suggesting dependence of this histone modification on the DNA sequence (Thomson et al. 2010). In keeping with this model, depletion of Cfp1 reduces H3K4me3 at many CGIs. Importantly, insertion of an artificial CGI-like DNA sequence into the genome results in recruitment of Cfp1 and creates a novel peak of H3K4me3 in the absence of RNAPII (Thomson et al. 2010). Further support for a mechanistic link between unmethylated CpG residues, Cfp1, and H3K4me3 comes from the finding that CpG density in CGIs correlates positively with H3K4me3 levels (Illingworth et al. 2010). The ability of CpG density alone to directly influence the chromatin modification state (Thomson et al. 2010) is likely to be a key function of CGIs.

The presence of H3K4me3 appears to facilitate transcription in a number of ways. The H3K4me3 tail has been shown to interact with the NuRF chromatin remodeling complex (Li et al. 2006 Wysocka et al. 2006 Ruthenburg et al. 2007) as well as ING4-containing histone acetyltransferase complexes (Saksouk et al. 2009). Also, H3K4me3 interacts with the transcriptional machinery directly, as the core transcription factor TFIID has an affinity for the H3K4me3 mark (Vermeulen et al. 2007 van Ingen et al. 2008). Core transcriptional machinery can recruit H3K4 methyltransferases to chromatin (for review, see Ruthenburg et al. 2007), so it is likely that transcription also contributes to H3K4me3 at CGIs. The relative contributions of CpG-mediated and transcription-mediated H3K4me3 to CGI chromatin modification have yet to be determined.

Another distinctive feature of CGI chromatin is depletion of histone H3K36 dimethylation (H3K36me2) compared with non-CGI promoters and gene bodies (Blackledge et al. 2010). The H3K36me2 histone demethylase Kdm2a (Tsukada et al. 2006) is a CXXC domain protein that, like Cfp1, binds specifically to nonmethylated CpG. Accordingly, Kdm2a is bound in vivo at ∼90% of CGIs in mouse ES cells and mediates demethylation of H3K36me2 at these regions (Blackledge et al. 2010). Why H3K36me2 should be depleted at CGIs is uncertain, but this modification has been reported to inhibit transcriptional initiation through histone deacetylase (HDAC) recruitment in yeast (Strahl et al. 2002 Youdell et al. 2008 Li et al. 2009). H3K36me2 depletion may therefore contribute to a transcriptionally permissive state at CGIs (Fig. 4A). Both Cfp1 and Kdm2a have the characteristics of CGI-specific proteins that use CpG density to influence chromatin modification. It is likely that more factors of this kind are yet to be identified, for example, by a comprehensive characterization of the CGI proteome.

The chromatin state at CGIs. (UNE) CGIs usually exist in an unmethylated transcriptionally permissive state. They are marked by histone acetylation (H3/H4Ac) and H3K4me3, which is directed by Cfp1, and show Kdm2a-dependent H3K36me2 depletion. Nucleosome deficiency and constitutive binding of RNAPII may also contribute to this transcriptionally permissive state. (B) DNA methylation is associated with stable long-term silencing of CGI promoters. This can be mediated by MBD proteins, which recruit corepressor complexes associated with HDAC activity, or may be due to directed inhibition of transcription factor binding by DNA methylation. (C) CGIs can also be silenced by PcG proteins and may be key elements involved in polycomb recruitment. An unknown CGI-binding factor could be responsible for recruiting PRC2 to CGIs that then trimethylates H3K27. This H3K27me3 is recognized by PRC1 complexes that act to impede transcriptional elongation, thereby silencing genes. Note that the transcriptionally permissive and polycomb-repressed states can coexist at bivalent CGIs, predominantly in totipotent embryonic cells.


R-loop formation is a distinctive characteristic of unmethylated human CpG island promoters

CpG islands (CGIs) function as promoters for approximately 60% of human genes. Most of these elements remain protected from CpG methylation, a prevalent epigenetic modification associated with transcriptional silencing. Here, we report that methylation-resistant CGI promoters are characterized by significant strand asymmetry in the distribution of guanines and cytosines (GC skew) immediately downstream from their transcription start sites. Using innovative genomics methodologies, we show that transcription through regions of GC skew leads to the formation of long R loop structures. Furthermore, we show that GC skew and R loop formation potential is correlated with and predictive of the unmethylated state of CGIs. Finally, we provide evidence that R loop formation protects from DNMT3B1, the primary de novo DNA methyltransferase in early development. Altogether, these results suggest that protection from DNA methylation is a built-in characteristic of the DNA sequence of CGI promoters that is revealed by the cotranscriptional formation of R loop structures.

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Les figures

Figure 1. Co-oriented positive GC skew is…

Figure 1. Co-oriented positive GC skew is a common property of strong human CGI promoters

Figure 2. Formation of genomic R-loops at…

Figure 2. Formation of genomic R-loops at the endogenous SNRPN CGI promoter

Figure 3. R-loop formation at the endogenous…

Figure 3. R-loop formation at the endogenous APOE promoteur

All symbols are as described in…

Figure 4. Formation of genomic R-loops at…

Figure 4. Formation of genomic R-loops at the endogenous mouse Airn CGI promoter

Figure 5. Widespread R-loop formation at human…

Figure 5. Widespread R-loop formation at human promoters

Figure 6. R-loop formation potential is predictive…

Figure 6. R-loop formation potential is predictive of the unmethylated status of CGI promoters


Эпигенетический контроль экспрессии генов

While the human genome sequence has transformed our understanding of human biology, it isn’t just the sequence of your DNA that matters, but also how you use it! How are some genes activated and others are silenced? How is this controlled? La réponse est l'épigénétique. Epigenetics has been a hot topic for research over the past decade as it has become clear that aberrant epigenetic control contributes to disease (particularly to cancer). Epigenetic alterations are heritable through cell division, and in some instances are able to behave similarly to mutations in terms of their stability. Importantly, unlike genetic mutations, epigenetic modifications are reversible and therefore have the potential to be manipulated therapeutically. It has also become clear in recent years that epigenetic modifications are sensitive to the environment (for example diet), which has sparked a large amount of public debate and research. This course will give an introduction to the fundamentals of epigenetic control. We will examine epigenetic phenomena that are manifestations of epigenetic control in several organisms, with a focus on mammals. We will examine the interplay between epigenetic control and the environment and finally the role of aberrant epigenetic control in disease. All necessary information will be covered in the lectures, and recommended and required readings will be provided. There are no additional required texts for this course. For those interested, additional information can be obtained in the following textbook. Epigénétique. Allis, Jenuwein, Reinberg and Caparros. Cold Spring Harbour Laboratory Press. ISBN-13: 978-0879697242 | Edition: 1

Олучаемые навыки

Cancer, Molecular Biology, Cancer Epigenetics, Dna Methylation

Ецензии

This is an excellent course that introduces you to fundamental knowledge of several hot topics in the field of epigenetics. Dr. Blewitt herself studies X inactivation, and I learned so much!

Amazingly structured and delivered course by the entire team. Including a few practical assays or how to read some of the assay results related to epigenetic techniques would be welcome.

An introduction to and definition of epigenetic control of gene expression, and its importance in normal development. We will learn what chromatin is, and how its composition and packaging can alter gene expression. We’ll also discuss the best-characterised epigenetic modification, DNA methylation, and how it is not only implicated in regulating gene expression, but also in maintaining genome stability.

Реподаватели

Dr. Marnie Blewitt

Екст идео

So now we are going to go through in the next series of lectures, each of the specific epigenetic modifications that are called epigenetic marks, and they have functional consequences for how the genes are expressed and how the chromatin is packaged. So while we'll go through each of these. This is the relevance of these, and how they specifically relate to the epigenetic phenomena, or the particular examples we are going to go through in the later lectures, we'll deal with that in later lectures and just have brief highlights of that here. But we need to go through and learn about how each of these work in order to really be able to understand at the molecular level how these processes are working in other instances. So we're going to start with DNA methylation. So DNA methylation is, as it sounds, the addition of a methyl group to the DNA, and this happens at cytosines. So here we're showing a cytosine single ring base but we can add on a 5- methyl group so its added on to the 5 carbon the fifth carbon here. And the methyl group is CHC group that's added directly onto that base. We know that, in mammals, DNA methylation occurs almost exclusively at Cs that are followed by Gs. So cytosines are followed by guanines. And this is called a CpG dinucleotide. And that p is just for the phosphate bond between the two. There's good reason that it's found almost exclusively at CpG dinucleotides. And that's because these dinucleotides are symmetrical when you look at the other side, the other strand of DNA, and this allows them to be maintained through cell division. And you remember this is one of those hallmark features of epigenetic modifications. So, how is it then that DNA methylation can be laid down and how can it be copied mitotically? So how is it that it can have this mitotic memory? So he pictured is a very simple picture of a DNA strand, shown by the black lines, and then in the middle this CpG dinucleotide. And in each case the cytosine is methylated. So, this methylation, because it's close by to one another. The cytosine on the other strand is very close by, and so it's methylated as well. What happens when the cell divides? Sorry, I’ll go back a step and say that the first thing that happens, is that DNA methyltransferases. So these are enzymes, in mammals they're know as DNMT3A and DNMT3B, these lay down the methylation. And they do this in a de novo fashion. In other words, they work on DNA that begins out being unmethylated. So they lay down these, these methyl-marks during development. Then how is it that it can be maintained? Well if we go through cell division, we have the parent strand in each case shown here in black. And the daughter strand shown in green. So, when the DNA is replicated, there's only going to be the parent strand that maintains the methyl group on that side within the CPG dinucleotide. And then the daughter strand, now, shown in green we have an unmethylated cytosine in each case. Now, what happens is we bring in DNMT1, so another DNA methyltransferase enzyme, and this stain of methyltransferase specifically recognises hemi-methylated DNA. It has a preference for hemi-methylated DNA, that is where one strand is methylated and the other is not. And this hemi-methylated DNA is then bound DNMT1. And DNMT1 the lays down methylation on the daughter strand and we have the restoration of a fully methlayted CPG dinucleotide. And this is how we know that DNA methylation can be a stable epigenetic mark. Because at every cell division, this DNA methylation will be copied by DNMT1 onto the new daughter strands of DNA. So we know I said that CpGs are where you, you mostly find methylation, or almost exclusively find methylation in mammals. So where are these CpG's found? Well many CpG’s are found in what are CPG islands. So this is where you find more CG dinucleotides than you would expect by chance and they tend to be found at the promoters of gene’s. So these, promoter are just to remind you is the region upstream of the start side of transcription of the gene and it's where the transcription factors bind. The general rule to remember is that CpG islands although they have many CpG’s there in fact tend to be protected from methylation, so methylation doesn't tend to occur at CpG islands. It tends to be that it occurs at other places in the genome. But if you do find methylation of CpG island. Then, this is almost universally synonymous with silencing of gene expression. So, DNA methylation is an inactive epigenetic mark. So, there are some CpG islands in the genome that are found to be methylated. So, while the general rule is that they are unmethylated There are some that are associated with gene silencing, and these are found at particular times and with dynamic methylation between different cell types. However, it’s mostly being studied, DNA methylation at CpG islands, for the inactive X chromosomes that I have mentioned a few times. So Iɽ like to go into a little bit more detail here about X inactivation. So, the reason for that is X inactivation really clearly demonstrates the mitotic heritability of DNA methylation. So we know that females have two X chromosomes, where as males have one X and one Y. So if we just consider the nucleus of these female and male cells, then the female cell will have twice the dose of all the genes that reside on the X chromosome, of which there are over 1000 genes. This in fact is not what ends up happening. What happens is that one of those two X chromosomes, either the one you inherited from your mom or the one you inherited from your dad, is chosen and its densely packed down in a cell as shown here. And this is called the inactive X chromosome. So while females have two X chromosomes they only ever use one. The second goes by unused. And is put in indeed is even put to the side in the nucleus literally put to the side. So what's interesting is this - when this X inactivation first occurs it occurs when there are only a few hundred cells in the embryo at gastrulation. And we know that when this choice is made it's a random choice. So each cell at that couple-of-hundred-cell stage can make the choice individually as to which X chromosome to inactivate - the one from your mom or the one from your dad. That choice is then mitotically heritable to all of the daughter cells. So, this X inactivation involves DNA methylation of the CpG islands. All thousand of them or so, or almost all thousand of them on the inactive X chromosome. And it's this mitotic heritability after the choice is made is partly ensured by the DNA methylation of those CpG islands. So, this is actually able to be observed in a visible way in the coat colour of cats. So, I'm going to show you a small movie here which is about Calico cats. What we can see, is that Calico cats, that are shown in this picture here, have genes that encode the coat colour genes are on the X chromosome. So, they can either have the ginger version or the black version. And then the choice is made early in development to have the ginger one being active or the black one being active. And the other one is silenced. The other chromosome is silenced. And so you end up with these cats that have a mottled appearance based on when that choice of which X to be inactivated was made early in development. So this could, is also the case not only in cats, of course, but is also true in humans. So in humans if we had a coat colour marker like this, which of course we don't, but if we had a coat colour marker like this, you would actually see these patches of green skin and patches of pink skin, based on when that choice was made early in development. Just as in female, humans just as you see in female cats they have this Calico appearance if they happen to have the right genetics. It's also interesting to note then, that you actually can't get male Calico cats. Male Calico cats, if they exist, have had a mutation where they actually have two copies an X chromosome but still have a Y chromosome. Otherwise they could not have this Calico appearance, traditional mottled appearance. So, how is then that DNA methylation which we've just discussed is heritable for many cell divisions and if you think about it in human mammals can can be heritable for maybe a 100 years. How is it that the DNA methylation actually is associated with gene silencing? There are probably at least a couple of mechanisms by which this can happen. So perhaps the primary mechanism is because the CpG, these methylated CPGs. Are associated with a condensation of the chromatin, and the way that this happens in the primary case is because the methylated CpG is bound by methylated CpG binding proteins, which are otherwise known as MeCP1 and MeCP2. So these MeCP1 and MeCP2.proteins bind to the methylated CpG dinucleotide and they themselves can alter transcription because they possess a transcriptional repression domain. Alternatively the MeCP2 or CeCP1 protein can itself bring in it's own protein partners and they can condense the chromatin. But for this primary mechanism it seems to be the binding of the methylated CPG by the methylated binding protein domain family. Probably the secondary mechanism, which doesn't seem to be is important, but can occasionally occur is that the methylated CpG will stop a transcription factor binding. So, transcription factors have particular binding sites. Say for example C,G,A,T. So, this binding site might be bound by a protein, a transcription factor, and it will then enable the transcription of a neighbouring gene, or the nearby gene. However, if this particular site now has the same sequence C,G,A,T, but its a methylated C,G,A,T, this will then block the binding of that transcription factor. So just that small addition of the methyl group will not allow the transcription factor to bind and therefore we don't have transcription in ensuing. So we don't think, although there are some specific examples of this occurring, for example for the transcription factor SP1 we don't think it's a generalisable mechanism and instead it seems to be just true For promoters that don't have so many CpGs. And so therefore, even single CpGs will have a large consequence. Rather we think that primary mechanism where the methylated CpG binding proteins bind to the methylated CpG is likely to be the most dominant mechanism within the nucleus.


DNA methylation establishment of CpG islands near maternally imprinted genes on chromosome 7 during mouse oocyte growth

Correspondance Qing-Yuan Sun, State Key Laboratory of Stem Cell and Reproductive Biology, Institute of Zoology, Chinese Academy of Sciences, 100101 Beijing, China.

Xiang-Hong Ou, Fertility Preservation Lab, Reproductive Medicine Center, Guangdong Second Provincial General Hospital, 510317 Guangzhou, China.

Fertility Preservation Lab, Reproductive Medicine Center, Guangdong Second Provincial General Hospital, Guangzhou, China

Correspondance Qing-Yuan Sun, State Key Laboratory of Stem Cell and Reproductive Biology, Institute of Zoology, Chinese Academy of Sciences, 100101 Beijing, China.

Xiang-Hong Ou, Fertility Preservation Lab, Reproductive Medicine Center, Guangdong Second Provincial General Hospital, 510317 Guangzhou, China.

State Key Laboratory of Stem Cell and Reproductive Biology, Institute of Zoology, Chinese Academy of Sciences, Beijing, China

Fertility Preservation Lab, Reproductive Medicine Center, Guangdong Second Provincial General Hospital, Guangzhou, China

Fertility Preservation Lab, Reproductive Medicine Center, Guangdong Second Provincial General Hospital, Guangzhou, China

State Key Laboratory of Stem Cell and Reproductive Biology, Institute of Zoology, Chinese Academy of Sciences, Beijing, China

State Key Laboratory of Stem Cell and Reproductive Biology, Institute of Zoology, Chinese Academy of Sciences, Beijing, China

State Key Laboratory of Stem Cell and Reproductive Biology, Institute of Zoology, Chinese Academy of Sciences, Beijing, China

State Key Laboratory of Stem Cell and Reproductive Biology, Institute of Zoology, Chinese Academy of Sciences, Beijing, China

Department of Veterinary Pathobiology, University of Missouri, Columbia, Missouri

State Key Laboratory of Stem Cell and Reproductive Biology, Institute of Zoology, Chinese Academy of Sciences, Beijing, China

Ferring Institute of Reproductive Biology, FIRM, Beijing, China

Correspondance Qing-Yuan Sun, State Key Laboratory of Stem Cell and Reproductive Biology, Institute of Zoology, Chinese Academy of Sciences, 100101 Beijing, China.

Xiang-Hong Ou, Fertility Preservation Lab, Reproductive Medicine Center, Guangdong Second Provincial General Hospital, 510317 Guangzhou, China.

Fertility Preservation Lab, Reproductive Medicine Center, Guangdong Second Provincial General Hospital, Guangzhou, China

Correspondance Qing-Yuan Sun, State Key Laboratory of Stem Cell and Reproductive Biology, Institute of Zoology, Chinese Academy of Sciences, 100101 Beijing, China.

Xiang-Hong Ou, Fertility Preservation Lab, Reproductive Medicine Center, Guangdong Second Provincial General Hospital, 510317 Guangzhou, China.

Résumé

The genome methylation is globally erased in early fetal germ cells, and it is gradually re-established during gametogenesis. The expression of some imprinted genes is regulated by the methylation status of CpG islands, while the exact time of DNA methylation establishment near maternal imprinted genes during oocyte growth is not well known. Here, growing oocytes were divided into three groups based on follicle diameters including the S-group (60–100 μm), M-group (100–140 μm), and L-group (140–180 μm). The fully grown germinal vesicle (GV)-stage and metaphase II (M2)-stage mature oocytes were also collected. These oocytes were used for single-cell bisulfite sequencing to detect the methylation status of CpG islands near imprinted genes on chromosome 7. The results showed that the CpG islands near Ndn, Magel2, Mkrn3, Peg12, et Igf2 were completely unmethylated, but those of Peg3, Snrpn, et Kcnq1ot1 were hypermethylated in MII-stage oocytes. The methylation of CpG islands near different maternal imprinted genes occurred asynchronously, being completed in later-stage growing oocytes, fully grown GV oocytes, and mature MII-stage oocytes, respectively. These results show that CpG islands near some maternally imprinted genes are not necessarily methylated, and that the establishment of methylation of other maternally imprinted genes is completed at different stages of oocyte growth, providing a novel understanding of the establishment of maternally imprinted genes in oocytes.


Epigenetics & Memory: How siRNA and Epimutations Help Yeast Cells Remember Their Past

They say that memory is the first thing to go as we get older. Memory research, and neuroscience in general, is one of the most fascinating areas of research. How do the different experiences we face every day shape our memories, and how does our brain know which memories to hold on to and which to let slip away?

It is difficult to study memory at a molecular level in humans and other mammals, so scientists often turn to model organisms like yeast to investigate the basic mechanisms involved behind making and remembering memories.

Lea Duempelmann and colleagues in Switzerland and the Netherlands recently described a phenomenon of transgenerational memory at the molecular level in the fission yeast, Schizosaccharomyces pombe. They were able to show that RNA-induced silencing of gene expression was mediated by epigenetic methods (trimethylation of histone H3 on lysine 9, H3K9me3) and that their yeast cells maintained a &ldquomemory&rdquo of this epigenetic silencing.

The team of researchers observed that the RNA-induced silent state of the gene encoding polymerase-associated factor 1 (Paf1) in S. pombe was stably maintained for at least 18 generations. When Paf1 was reintroduced to the yeast cells, the original silencing was lost. However, when Paf1 activity was impaired again later, the silencing was restored, even if the RNA-mediated silencing mechanism was no longer present.

While this study focused on a specific type of epigenetic memory in yeast, it's exciting to see scientists starting to unravel how organisms can remember their past experiences at a molecular level and we're looking forward to seeing what will come next.

Référence: Duempelmann, L. et al. Inheritance of a Phenotypically Neutral Epimutation Evokes Gene Silencing in Later Generations. Mol. Cellule (2019)
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