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Mécanisme de liaison basique des résidus d'acides aminés à l'ADN

Mécanisme de liaison basique des résidus d'acides aminés à l'ADN


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Je comprends que de nombreux domaines de liaison à l'ADN des protéines se lient à l'ADN via des résidus basiques tels que l'arginine et la lysine. Mais quel est le mécanisme utilisé pour se lier à l'ADN et où sur l'ADN ces résidus se lieraient-ils ?


Cette question n'a pas de réponse particulière. Il existe plusieurs familles de protéines de liaison à l'ADN, certaines d'entre elles se lient spécifiquement (par exemple des enzymes de restriction comme EcoRI qui se lie à et coupe GAATTC ou des facteurs de transcription comme le répresseur lac qui se lie à un point particulier du génome d'e coli d'environ 25 paires de bases de long) et certaines d'entre eux se lient de manière semi-spécifique (par exemple les doigts de zinc qui se lient aux régions riches en GC), d'autres de manière non spécifique (par exemple la pince à ADN coulissante).

Pour toutes ces protéines, elles auront tendance à avoir des acides aminés chargés positivement face à l'ADN car le squelette phosphate de l'ADN est chargé négativement. Il existe de nombreux motifs protéiques (comme le motif hélice tournant hélice) qui s'insèrent dans le sillon majeur ou mineur de l'ADN. La lysine et l'argénine sont importantes car ce sont les acides aminés chargés positivement. L'histidine est également chargée positivement, mais elle n'est pas aussi longue et flexible, et ne semble pas s'adapter aussi souvent ou aussi bien.

http://en.wikipedia.org/wiki/DNA-binding_protein


Je ferais un commentaire si je pouvais, mais notre laboratoire a travaillé avec beaucoup de peptides de poly lysine pour lier l'ADN. D'après notre expérience, la lysine fonctionne mieux que l'arginine, et les deux fonctionnent beaucoup mieux que l'histidine. L'histidine a un pka plus faible, elle a donc tendance à être moins chargée positivement au pH physiologique. En ce qui concerne les protéines se liant à une séquence d'ADN spécifique, la double hélice a deux sillons, majeur et mineur. Les "côtés" des paires de bases sont accessibles à travers les sillons, et les protéines reconnaissent probablement des motifs dans ces sillons. Une paire A-T présente une forme différente de celle d'une paire G-C, et les portions de liaison à l'ADN des protéines peuvent discriminer ces bosses et se lier à l'hélice.


3 Chimie organique de base pour la biologie

La chimie organique est une branche de la chimie qui étudie la structure, les propriétés et les réactions des composés organiques, qui contiennent du carbone dans une liaison covalente. L'étude de la structure détermine leur composition chimique et leur formule. L'étude des propriétés comprend les propriétés physiques et chimiques et l'évaluation de la réactivité chimique pour comprendre leur comportement. L'étude des réactions organiques comprend la synthèse chimique de produits naturels, de médicaments et de polymères, et l'étude de molécules organiques individuelles en laboratoire et via une étude théorique (in silico).

Les composés organiques forment la base de toute vie terrestre et constituent la majorité des produits chimiques connus. Les modèles de liaison du carbone, avec sa valence de quatre - liaisons formelles simples, doubles et triples, ainsi que des structures avec des électrons délocalisés - rendent la gamme de composés organiques structurellement diversifiée et leur gamme d'applications énorme. Ils forment la base de, ou sont des constituants de, de nombreux produits commerciaux, y compris les produits pharmaceutiques, pétrochimiques et agrochimiques, et les produits fabriqués à partir de ceux-ci, notamment les lubrifiants, les solvants, les plastiques, les carburants et les explosifs. L'étude de la chimie organique chevauche la chimie organométallique et la biochimie, mais aussi la chimie médicinale, la chimie des polymères et la science des matériaux.

La gamme des produits chimiques étudiés en chimie organique comprend les hydrocarbures (composés ne contenant que du carbone et de l'hydrogène) ainsi que des composés à base de carbone, mais contenant également d'autres éléments, notamment l'oxygène, l'azote, le soufre, le phosphore (compris dans de nombreux produits biochimiques) et les halogènes.

Avant le XIXe siècle, les chimistes croyaient généralement que les composés obtenus à partir d'organismes vivants étaient dotés d'une force vitale qui les distinguait des composés inorganiques. Selon le concept de vitalisme (théorie de la force vitale), la matière organique était dotée d'une « force vitale ». Au cours de la première moitié du XIXe siècle, certaines des premières études systématiques des composés organiques ont été signalées. Vers 1816, Michel Chevreul a commencé une étude de savons fabriqués à partir de diverses graisses et alcalis. Il a séparé les acides qui, en combinaison avec l'alcali, ont produit le savon. Comme il s'agissait tous de composés individuels, il a démontré qu'il était possible de modifier chimiquement diverses graisses (qui proviennent traditionnellement de sources organiques), produisant de nouveaux composés, sans « force vitale ». En 1828, Friedrich Wöhler a produit l'urée chimique organique (carbamide), un constituant de l'urine, à partir de matières premières inorganiques (les sels de cyanate de potassium et de sulfate d'ammonium), dans ce qu'on appelle maintenant la synthèse de Wöhler. Bien que Wöhler lui-même ait été prudent en affirmant qu'il avait réfuté le vitalisme, c'était la première fois qu'une substance considérée comme organique était synthétisée en laboratoire sans matières premières biologiques (organiques). L'événement est maintenant généralement accepté comme réfutant en effet la doctrine du vitalisme.

Une percée cruciale pour la chimie organique a été le concept de structure chimique, développé indépendamment en 1858 par Friedrich August Kekulé et Archibald Scott Couper. Les deux chercheurs ont suggéré que les atomes de carbone tétravalents pourraient se lier les uns aux autres pour former un réseau de carbone, et que les modèles détaillés de liaison atomique pourraient être discernés par des interprétations habiles des réactions chimiques appropriées.

Les molécules organiques sont généralement décrites par des dessins ou des formules structurelles, des combinaisons de dessins et de symboles chimiques. La formule ligne-angle est simple et sans ambiguïté. Dans ce système, les extrémités et les intersections de chaque ligne représentent un carbone, et les atomes d'hydrogène peuvent être soit notés explicitement, soit supposés être présents comme le laisse supposer le carbone tétravalent.

Figure 3.1 : Ce diagramme montre 5 représentations structurelles différentes du composé organique butane. La structure la plus à gauche est un dessin de ligne de liaison où les atomes d'hydrogène sont supprimés. La 2ème structure a les hydrogènes ajoutés représentés - les liaisons en coin sombres indiquent que les atomes d'hydrogène se dirigent vers le lecteur, les liaisons hachées indiquent que les atomes sont orientés loin du lecteur et les étangs solides (unis) indiquent que les liaisons sont dans le plan de l'écran/du papier. La structure du milieu montre les quatre atomes de carbone. La 4ème structure est une représentation montrant juste les atomes et les liaisons sans 3 dimensions. La structure la plus à droite est une représentation de la structure condensée du butane.

L'ère de l'industrie pharmaceutique a commencé dans la dernière décennie du XIXe siècle lorsque la fabrication d'acide acétylsalicylique, plus communément appelée aspirine, a été lancée en Allemagne par Bayer. En 1910, Paul Ehrlich et son groupe de laboratoire ont commencé à développer l'arsphénamine à base d'arsenic (Salvarsan), en tant que premier traitement médicamenteux efficace de la syphilis, et ont ainsi lancé la pratique médicale de la chimiothérapie. Ehrlich a popularisé les concepts de médicaments « balles magiques » et d'amélioration systématique des thérapies médicamenteuses. Son laboratoire a apporté des contributions décisives au développement d'antisérums contre la diphtérie et à la standardisation des sérums thérapeutiques.

Au début du 20e siècle, les polymères et les enzymes se sont avérés être de grosses molécules organiques, et le pétrole s'est avéré être d'origine biologique.

La majorité des composés chimiques présents dans les organismes biologiques sont des composés carbonés, de sorte que l'association entre la chimie organique et la biochimie est si étroite que la biochimie pourrait être considérée comme une branche de la chimie organique. Bien que l'histoire de la biochimie puisse s'étendre sur environ quatre siècles, la compréhension fondamentale du domaine n'a commencé à se développer qu'à la fin du XIXe siècle et le terme de biochimie a été inventé vers le début du XXe siècle.


Étapes impliquées dans le mécanisme de synthèse des protéines | Génétique | La biologie

Le mécanisme de synthèse des protéines a été étudié en profondeur chez E. coli. Le processus de synthèse des protéines sur les ribosomes 70S est décrit en détail ci-dessous. Le résumé des différentes étapes du mécanisme de synthèse des protéines est présenté dans (Fig. 13).

Étape 1 — Transcription :

Un brin de molécule d'ADN fonctionne comme une matrice pour la formation d'ARNm. Cet ARNm contient le message pour la protéine à synthétiser. Dès que l'ARNm est formé, il quitte le noyau et atteint le cytoplasme où il se fixe avec la sous-unité 30S des ribosomes.

Étape 2 - Attachement de l'ARNm à la sous-unité 30S des ribosomes :

Dans les cellules procaryotes, les ribosomes se trouvent dans un état dissocié et inactif. L'ARNm se lie à la sous-unité 30S. Des séquences spécifiques de l'ARNr 16 S de la petite sous-unité du ribosome se lient à la séquence complémentaire de l'ARNm. Le premier acide aminé, qui est généralement le N formyl méthionine-ARNt (ARNt F-met) se fixe à l'ARNm pour former le complexe d'initiation.

Ce processus est aidé par le GTP et trois facteurs protéiques (facteurs IF1, IF2 et IF3). Le ribosome est spécialement conçu pour réunir l'ARNm et l'ARNt. L'ARNm est enfilé à travers le tunnel de la petite sous-unité, tandis que la grande et la sous-unité s'emboîtent pour former des poches de liaison à l'ARNt. Après la formation du complexe d'initiation, la sous-unité 50S se joint à la plus petite sous-unité pour former le ribosome 70S.

Étape 3 - Transfert d'acides aminés sur le site de synthèse des protéines :

Au cours de cette étape, les acides aminés sont transportés du pool d'acides aminés vers les ribosomes. Mais les acides aminés se produisent dans le cytoplasme à l'état inactif. Chaque acide aminé est activé par une enzyme d'activation spécifique connue sous le nom d'amino acyl synthétase et d'ATP.

La cellule a au moins 20 enzymes aminoacyl synthétase pour les 20 acides aminés. Chaque enzyme est spécifique et active le bon acide aminé. L'enzyme est reconnue par le site enzymatique de l'ARNt et le résidu d'acide aminé est transféré au site de fixation d'acide aminé de l'ARNt. L'acide aminé est lié au 3-OH à l'extrémité -CCA de l'ARNt. En conséquence, l'AMP et l'enzyme sont libérés et le produit final amino acyl-ARNt est formé. Cela se déplace vers le site de synthèse des protéines.

Étape 4 - Initiation de la synthèse des protéines :

L'initiation implique la formation du complexe 70S et est facilitée par des facteurs d'initiation.

L'ARNm a généralement AUG comme premier codon. Codes AUG pour la méthionine. La méthionine est formulée et joue un rôle important dans l'initiation du processus de synthèse des protéines. Une fois la synthèse protéique terminée, la formyl méthionine est détachée par l'activité de l'enzyme hydrolytique.

La fonction de la formyl méthionine est d'assurer que la synthèse des protéines progresse dans une direction spécifique. En effet, dans la formyl méthionine, le NH2 est bloqué par le groupe formyle laissant l'extrémité -COOH réagir avec le -NH2 groupe du deuxième acide aminé.

Le processus d'initiation diffère significativement chez les procaryotes et les eucaryotes. Trois facteurs d'initiation sont impliqués dans les procaryotes – IF1, IF2 et IF3. L'initiation chez les eucaryotes est plus complexe et nécessite 8 facteurs d'initiation. (Tableau 8). Le premier acide aminé est la méthionine chez les eucaryotes.

Étape 5 - Allongement de la chaîne polypeptidique :

Lors de l'allongement, les acides aminés sont liés les uns aux autres. Le processus d'allongement nécessite des facteurs d'allongement, EF-Tu, Ef-G et EF-T. Un ARNt chargé avec l'anticodon complémentaire du codon de l'ARNm est amené au site A du ribosome. La formation de peptides se produit entre les acides aminés du site P et le site A en présence de l'enzyme peptidyl transférase.

La réaction de peptidyl transférase transfère l'acide aminé, du site P sur l'amino acyl-ARNt dans le site A. Le deuxième ARNt porte maintenant un dipeptide et le premier ARNt est sans acide aminé.

L'étape suivante de l'élongation est le mouvement des ribosomes par un codon le long de l'ARNm. C'est ce qu'on appelle la translocation. L'enzyme impliquée dans cette réaction est la translocase. La translocation nécessite de l'énergie, qui est fournie par l'hydrolyse du GTP. Au fur et à mesure que la translocation se produit, l'ARNt avec le dipeptide se déplace vers le site P et un nouveau codon est disponible dans le site A. Le premier ARNt se déplace maintenant vers le site ‘E’. Cet ARNt est « éjecté » par l'action de la transférase, qui est également responsable du basculement de la formyl-méthionine vers l'ARNt présent maintenant sur le site P.

En bref, l'ensemble du processus implique l'arrivée du complexe ARNt-acides aminés, la formation de liaisons peptidiques et la translocation. Lorsque les ribosomes se déplacent sur l'ARNm dans la direction 5′ → 3′, tous les codons sont exposés au site A l'un après l'autre et il y a une croissance ultérieure de la chaîne polypeptidique.

Ainsi, le langage de l'ADN est transcrit dans le langage de l'ARNm qui est ensuite traduit dans le langage des polypeptides. Le polypeptide nouvellement synthétisé est connu sous le nom de polypeptide naissant. La séquence des événements d'allongement se produit très rapidement et dans des conditions optimales, une chaîne polypeptidique de 40 acides aminés peut être produite en 20 secondes.

Étape - 6 Terminaison et libération de la chaîne polypeptidique :

À la fin de la chaîne d'ARNm, il y a un codon d'arrêt ou de terminaison. Il existe trois codons de terminaison - UAA, UGA et UAG.

Lorsque la région de traitement de l'information rencontre un codon terminateur, elle signale l'arrêt de la synthèse des protéines. Un facteur de libération rejoint le codon stop et cela facilite l'hydrolyse de la chaîne polypeptidique complète à partir du site P. Le ribosome se sépare de la chaîne d'ARNm et le ribosome se dissocie en deux sous-unités.

Étape - 7 Modification du polypeptide libéré :

Le polypeptide libéré est sous sa forme primaire. Il subit un enroulement et acquiert une structure secondaire et tertiaire. Il peut se combiner avec d'autres polypeptides pour prendre une structure quaternaire. Les protéines appelées chaperons aident au repliement des protéines pour qu'elles deviennent fonctionnelles.

Les protéines synthétisées sur les ribosomes libres sont libérées dans le cytoplasme et fonctionnent comme des protéines structurelles et enzymatiques. Les protéines formées sur les ribosomes attachés, traversent le tunnel dans les canaux du RE et sont exportées sous forme de sécrétions cellulaires par exocytose après conditionnement dans l'appareil de Golgi.

L'ARNm et le ribosome sont réutilisables. Parfois, de nombreux ribosomes lisent une molécule d'ARNm à la fois. Ils forment des polysomes ou des polyribosomes produisant de nombreux polypeptides identiques. Les polypeptides, lorsqu'ils sont libérés, forment des protéines qui peuvent prendre une structure secondaire, tertiaire ou quaternaire. La séquence d'ADN qui code pour une chaîne polypeptidique est appelée cistron ou gène.


L'activité catalytique des enzymes

Comme tous les autres catalyseurs, les enzymes se caractérisent par deux propriétés fondamentales. Premièrement, ils augmentent la vitesse des réactions chimiques sans être eux-mêmes consommés ou altérés de façon permanente par la réaction. Deuxièmement, ils augmentent les vitesses de réaction sans altérer l'équilibre chimique entre les réactifs et les produits.

Ces principes de catalyse enzymatique sont illustrés dans l'exemple suivant, dans lequel une molécule sur laquelle agit une enzyme (appelée substrat [S]) est converti en un produit (P) à la suite de la réaction. En l'absence de l'enzyme, la réaction peut s'écrire comme suit :

L'équilibre chimique entre S et P est déterminé par les lois de la thermodynamique (comme discuté plus en détail dans la section suivante de ce chapitre) et est représenté par le rapport des vitesses de réaction directe et inverse (SP et PS, respectivement). En présence de l'enzyme appropriée, la conversion de S à P est accéléré, mais l'équilibre entre S et P est inchangé. Par conséquent, l'enzyme doit accélérer de manière égale les réactions directes et inverses. La réaction peut s'écrire comme suit :

Notez que l'enzyme (E) n'est pas altéré par la réaction, de sorte que l'équilibre chimique reste inchangé, déterminé uniquement par les propriétés thermodynamiques de S et P.

L'effet de l'enzyme sur une telle réaction est mieux illustré par les changements d'énergie qui doivent se produire pendant la conversion de S à P (Figure 2.22). L'équilibre de la réaction est déterminé par les états d'énergie finaux de S et P, qui ne sont pas affectés par la catalyse enzymatique. Pour que la réaction se déroule, cependant, le substrat doit d'abord être converti en un état d'énergie plus élevée, appelé le état de transition. L'énergie nécessaire pour atteindre l'état de transition (l'énergie d'activation) constitue une barrière à la progression de la réaction, limitant la vitesse de la réaction. Les enzymes (et autres catalyseurs) agissent en réduisant l'énergie d'activation, augmentant ainsi la vitesse de réaction. Le taux accru est le même dans les deux sens avant et arrière, puisque les deux doivent passer par le même état de transition.

Graphique 2.22

Diagrammes d'énergie pour les réactions catalysées et non catalysées. La réaction illustrée est la simple conversion d'un substrat S à un produit P. Parce que l'état énergétique final de P est inférieur à celui de S, la réaction se déroule de gauche à droite. Pour le (plus. )

L'activité catalytique des enzymes implique la liaison de leurs substrats pour former un complexe enzyme-substrat (ES). Le substrat se lie à une région spécifique de l'enzyme, appelée site actif. Alors qu'il est lié au site actif, le substrat est converti en produit de la réaction, qui est ensuite libéré de l'enzyme. La réaction catalysée par une enzyme peut ainsi s'écrire comme suit :

Noter que E apparaît inchangé des deux côtés de l'équation, donc l'équilibre n'est pas affecté. Cependant, l'enzyme fournit une surface sur laquelle les réactions de conversion S à P peut se produire plus facilement. Ceci est le résultat d'interactions entre l'enzyme et le substrat qui abaissent l'énergie d'activation et favorisent la formation de l'état de transition.


Discussion

ELYS joue un rôle clé dans l'assemblage de NPC post-mitotique médié par les nucléosomes 16,17,18. En fait, ELYS se lie au nucléosome in vitro et co-purifié avec des histones in vivo 23,24. Cependant, le mécanisme de la liaison ELYS-nucléosome n'a pas encore été élucidé. Dans la présente étude, nous avons reconstruit la structure de l'ELYSC–complexe nucléosome par la méthode cryo-EM (Figs. 3 et 4). La structure cryo-EM, combinée à la spectrométrie de masse de réticulation, a démontré que la région C-terminale d'ELYS, y compris l'étirement RRK, est importante pour la liaison au patch acide à la surface du nucléosome (Figs. 3-5). De manière cohérente, les analyses biochimiques ont révélé que les résidus Arg et Lys dans l'étirement ELYS RRK fonctionnaient dans la liaison du nucléosome (figures 1 et 2).

Le tronçon RRK contenant les résidus Arg-Arg-Lys est hautement conservé parmi les orthologues ELYS (Fig. 2a). Cependant, l'importance fonctionnelle de ces résidus n'a pas été clarifiée. Ici, nous avons constaté que l'étirement RRK fonctionne en se liant au patch acide nucléosomique.Le patch acide comprend les résidus d'acides aminés acides H2A et H2B, qui sont exposés des deux côtés de la surface du nucléosome (Fig. 4). Les plaques acides du nucléosome fournissent des sites de liaison pour les facteurs associés à la chromatine, tels que RCC1, Sir3, PRC1, CENP-C et LANA 29,30,31,32,33. Dans ces protéines, la chaîne latérale de l'arginine se lie spécifiquement au patch acide sur le nucléosome et est appelée ancre arginine 27 . Dans l'ELYSC–complexe nucléosome, les résidus d'arginine dans le tronçon RRK d'ELYSC peut également fonctionner comme une ancre d'arginine. Nos analyses mutationnelles ont montré que les trois résidus basiques, mais pas chaque résidu, dans le tronçon RRK sont nécessaires pour la liaison du nucléosome (Fig. 2). Par conséquent, le mécanisme de liaison d'ELYSC au patch acide du nucléosome peut être quelque peu différent de celui du motif d'ancrage arginine conventionnel. Alternativement, l'un des deux résidus d'arginine dans le tronçon RRK peut fonctionner de manière redondante comme un ancrage d'arginine.

Conformément aux résultats précédents, nos analyses biochimiques ont révélé que la région AT-hook fonctionne également dans la liaison aux nucléosomes (Fig. 1). Il est important de noter que nos analyses mutationnelles ont démontré que la contribution de l'étirement RRK peut être supérieure à celle de la région AT-hook dans la liaison aux nucléosomes (Fig. 1). Dans l'ELYSC–structure complexe du nucléosome, la région AT-hook n'était pas visible, en raison de sa nature flexible. La région AT-crochet d'ELYS se lie à l'ADN 22,23. Les motifs AT-crochet d'autres protéines préféreraient se lier à des régions riches en AT contenant de l'ADN 22 . Par conséquent, la liaison à l'ADN de la région du crochet AT peut prendre en charge la liaison du nucléosome ELYS, qui est principalement médiée par la liaison de l'étirement RRK au patch acide.

Des analyses in vitro ont révélé que l'importine et la transportine se lient directement à la région C-terminale d'ELYS (2359–2408) mais pas à la région AT-hook 34 . La région de liaison d'importine et de transportine d'ELYS contient le tronçon RRK. Par conséquent, la liaison ELYS-nucléosome peut entrer en compétition avec l'importine et la liaison transportine et peut inhiber le recrutement ELYS à la chromatine 34,35. Ainsi, la libération d'ELYS de l'importine et de la transportine peut être une condition préalable à l'assemblage NPC 34,35. RanGTP affaiblirait les interactions ELYS-importine et ELYS-transportine 34,35. Par conséquent, la libération d'ELYS médiée par RanGTP à partir de l'importine et de la transportine peut être importante pour l'association ELYS-chromatine, qui est la principale étape de l'assemblage des NPC dans la phase post-mitotique.


Résumé

Le développement de méthodologies de détection au point de service pour les analytes biologiquement pertinents qui peuvent faciliter un traitement rapide et approprié est au premier plan des efforts et des intérêts de recherche actuels. Parmi les différentes approches, celles qui exploitent les chimies hôte-invité où les signaux optoélectroniques du capteur chimique peuvent être modulés lors de l'interaction avec l'analyte cible sont particulièrement intéressantes. Pour faciliter leur développement rationnel, une sélection judicieuse des groupes fonctionnels périphériques ancrés aux motifs centraux avec les propriétés souhaitées est essentielle. Nous rapportons ici une enquête approfondie sur la liaison de trois substances psychoactives, le MDAI, la mexédrone et le phénibut, aux récepteurs des transporteurs de monoamine pour la dopamine, la noradrénaline et la sérotonine, en mettant particulièrement l'accent sur le rôle des résidus d'acides aminés individuels. Nous avons d'abord évalué la flexibilité conformationnelle des ligands en comparant leurs géométries de structure cristalline déterminées expérimentalement à celles optimisées au moyen de la mécanique quantique et moléculaire, en observant des changements significatifs dans le cas du phénibut. Des études d'amarrage moléculaire ont été utilisées pour identifier les sites de liaison préférentiels au moyen de scores d'amarrage calculés. Dans tous les cas, quel que soit le transporteur de la monoamine, les substances psychoactives présentaient une interaction privilégiée avec le site S1 ou central des protéines, conformément aux études précédentes. Cependant, nous avons observé que les tendances expérimentales de leur puissance relative sur les trois transporteurs n'étaient reproduites que dans le cas de la mexédrone. Par la suite, pour mieux comprendre ces résultats et ouvrir la voie au développement rationnel de capteurs chimiques supérieurs pour ces substances, nous avons calculé les contributions individuelles de chaque résidu d'acide aminé le plus proche à la liaison aux analytes cibles. Fait intéressant, ces résultats sont maintenant en accord avec ces tendances de puissance expérimentale. De plus, ces observations étaient dans tous les cas associées à des interactions intermoléculaires clés avec des résidus voisins, tels que la tyrosine et l'acide aspartique, dans la liaison des ligands au transporteur monoamine de la dopamine. En conséquence, nous pensons que ce travail intéressera ceux qui sont engagés dans le développement rationnel de capteurs chimiques pour les analytes de petites molécules ainsi que pour ceux qui s'intéressent à l'utilisation d'approches informatiques pour mieux comprendre les interactions protéine-ligand.


Mécanisme de liaison basique des résidus d'acides aminés à l'ADN - Biologie

Protéines sont l'une des molécules organiques les plus abondantes dans les systèmes vivants et ont la gamme de fonctions la plus diversifiée de toutes les macromolécules. Les protéines peuvent être structurelles, régulatrices, contractiles ou protectrices, elles peuvent servir au transport, au stockage ou aux membranes ou elles peuvent être des toxines ou des enzymes. Chaque cellule d'un système vivant peut contenir des milliers de protéines, chacune ayant une fonction unique. Leurs structures, comme leurs fonctions, varient considérablement. Ce sont tous, cependant, des polymères de acides aminés, disposés dans une séquence linéaire.

Figure 1. Les acides aminés ont un carbone asymétrique central auquel un groupe amino, un groupe carboxyle, un atome d'hydrogène et une chaîne latérale (groupe R) sont attachés.

Acides aminés sont les monomères qui composent les protéines. Chaque acide aminé a la même structure fondamentale, qui se compose d'un atome de carbone central, également connu sous le nom d'alpha (??) carbone, lié à un groupe amino (NH2), un groupe carboxyle (COOH) et à un atome d'hydrogène. Chaque acide aminé a également un autre atome ou groupe d'atomes lié à l'atome central connu sous le nom de groupe R (Figure 1).

Le nom "acide aminé" est dérivé du fait qu'ils contiennent à la fois un groupe aminé et un groupe acide carboxylique dans leur structure de base. Comme mentionné, il y a 20 acides aminés présents dans les protéines. Neuf d'entre eux sont considérés comme des acides aminés essentiels chez l'homme car le corps humain ne peut pas les produire et ils sont obtenus à partir de l'alimentation.

Pour chaque acide aminé, le groupe R (ou chaîne latérale) est différent (figure 2).

Question de pratique

Figure 2. Il existe 20 acides aminés communs que l'on trouve couramment dans les protéines, chacun avec un groupe R différent (groupe variant) qui détermine sa nature chimique.

Quelles catégories d'acides aminés vous attendriez-vous à trouver à la surface d'une protéine soluble, et lesquelles vous attendriez-vous à trouver à l'intérieur ? Quelle distribution d'acides aminés vous attendriez-vous à trouver dans une protéine intégrée dans une bicouche lipidique ?

La nature chimique de la chaîne latérale détermine la nature de l'acide aminé (c'est-à-dire s'il est acide, basique, polaire ou non polaire). Par exemple, l'acide aminé glycine a un atome d'hydrogène comme groupe R. Les acides aminés tels que la valine, la méthionine et l'alanine sont de nature non polaire ou hydrophobe, tandis que les acides aminés tels que la sérine, la thréonine et la cystéine sont polaires et ont des chaînes latérales hydrophiles. Les chaînes latérales de la lysine et de l'arginine sont chargées positivement et, par conséquent, ces acides aminés sont également appelés acides aminés basiques. La proline a un groupe R qui est lié au groupe amino, formant une structure en forme d'anneau. La proline est une exception à la structure standard d'un acide aminé puisque son groupe aminé n'est pas séparé de la chaîne latérale (Figure 2).

Les acides aminés sont représentés par une seule lettre majuscule ou une abréviation de trois lettres. Par exemple, la valine est connue par la lettre V ou le symbole à trois lettres val. Tout comme certains acides gras sont essentiels à un régime, certains acides aminés sont également nécessaires. Ils sont connus sous le nom d'acides aminés essentiels et, chez l'homme, ils comprennent l'isoleucine, la leucine et la cystéine. Les acides aminés essentiels font référence à ceux nécessaires à la construction des protéines dans le corps, bien que non produits par le corps, les acides aminés essentiels varient d'un organisme à l'autre.

Figure 3. La formation de liaisons peptidiques est une réaction de synthèse par déshydratation. Le groupe carboxyle d'un acide aminé est lié au groupe amino de l'acide aminé entrant. Dans le processus, une molécule d'eau est libérée.

La séquence et le nombre d'acides aminés déterminent en fin de compte la forme, la taille et la fonction de la protéine. Chaque acide aminé est lié à un autre acide aminé par une liaison covalente, appelée liaison peptidique, qui est formée par une réaction de déshydratation. Le groupe carboxyle d'un acide aminé et le groupe aminé de l'acide aminé entrant se combinent, libérant une molécule d'eau. La liaison résultante est la liaison peptidique (figure 3).

Les produits formés par de telles liaisons sont appelés peptides. Au fur et à mesure que de plus en plus d'acides aminés se joignent à cette chaîne en croissance, la chaîne résultante est connue sous le nom de polypeptide. Chaque polypeptide a un groupe amino libre à une extrémité. Cette extrémité est appelée N terminal, ou amino terminal, et l'autre extrémité a un groupe carboxyle libre, également connu sous le nom de C ou carboxyle terminal. Alors que les termes polypeptide et protéine sont parfois utilisés de manière interchangeable, un polypeptide est techniquement un polymère d'acides aminés, alors que le terme protéine est utilisé pour un polypeptide ou des polypeptides qui se sont combinés, ont souvent lié des groupes prothétiques non peptidiques, ont une forme distincte , et ont une fonction unique. Après la synthèse des protéines (traduction), la plupart des protéines sont modifiées. Celles-ci sont connues sous le nom de modifications post-traductionnelles. Ils peuvent subir un clivage, une phosphorylation ou nécessiter l'ajout d'autres groupes chimiques. Ce n'est qu'après ces modifications que la protéine est complètement fonctionnelle.

L'importance évolutive du cytochrome c

Le cytochrome c est un composant important de la chaîne de transport d'électrons, une partie de la respiration cellulaire, et il se trouve normalement dans l'organite cellulaire, la mitochondrie. Cette protéine possède un groupe prothétique hème, et l'ion central de l'hème est alternativement réduit et oxydé pendant le transfert d'électrons. Parce que le rôle de cette protéine essentielle dans la production d'énergie cellulaire est crucial, elle a très peu changé au cours de millions d'années. Le séquençage des protéines a montré qu'il existe une quantité considérable d'homologie de séquence d'acides aminés du cytochrome c entre différentes espèces, en d'autres termes, la parenté évolutive peut être évaluée en mesurant les similitudes ou les différences entre les différentes espèces d'ADN ou de séquences protéiques.

Les scientifiques ont déterminé que le cytochrome c humain contient 104 acides aminés. Pour chaque molécule de cytochrome c provenant de différents organismes qui a été séquencée à ce jour, 37 de ces acides aminés apparaissent dans la même position dans tous les échantillons de cytochrome c. Cela indique qu'il peut y avoir eu un ancêtre commun. En comparant les séquences des protéines humaines et de chimpanzé, aucune différence de séquence n'a été trouvée. Lorsque les séquences de l'homme et du singe rhésus ont été comparées, la seule différence trouvée était dans un acide aminé. Dans une autre comparaison, le séquençage humain à levure montre une différence en 44e position.


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Dans : Virologie, Vol. 318, n° 1, 05.01.2004, p. 204-213.

Résultats de recherche : Contribution à la revue › Article › peer-review

T1 - Analyses génétiques et fonctionnelles de la protéine de liaison à l'ADN øx174

T2 - Les effets des substitutions pour les résidus d'acides aminés qui organisent spatialement les deux domaines de liaison à l'ADN

N1 - Informations sur le financement : Cette recherche a été financée par une subvention de la NSF (MCB0234976) à B.A. Fané.

N2 - La protéine de liaison à l'ADN øX174 contient deux domaines de liaison à l'ADN, contenant une série d'acides aminés basiques de liaison à l'ADN, séparés par une région de liaison riche en proline. Dans chaque domaine de liaison à l'ADN, il y a un résidu glycine conservé. Les résidus de glycine et de proline ont été mutés et les effets sur la structure du virion ont été examinés. Les substitutions de résidus de glycine donnent des particules ayant des propriétés similaires à celles des mutants précédemment caractérisés avec des substitutions de résidus de liaison à l'ADN. Les deux ensembles de mutations partagent un suppresseur de deuxième site extragénique commun, ce qui suggère que les défauts causés par les protéines mutantes sont mécaniquement similaires. Par conséquent, les résidus de glycine peuvent optimiser les contacts ADN-protéine. Les défauts conférés par les substitutions de résidus proline semblent être fondamentalement différents. Les propriétés des particules mutantes ainsi que la structure atomique du virion suggèrent que les résidus de proline peuvent agir pour guider l'ADN emballé vers l'unité asymétrique adjacente liée quintuple, empêchant ainsi un arrangement d'emballage chaotique.

AB - La protéine de liaison à l'ADN øX174 contient deux domaines de liaison à l'ADN, contenant une série d'acides aminés basiques de liaison à l'ADN, séparés par une région de liaison riche en proline. Dans chaque domaine de liaison à l'ADN, il y a un résidu glycine conservé. Les résidus de glycine et de proline ont été mutés et les effets sur la structure du virion ont été examinés. Les substitutions de résidus de glycine donnent des particules ayant des propriétés similaires à celles des mutants précédemment caractérisés avec des substitutions de résidus de liaison à l'ADN. Les deux ensembles de mutations partagent un suppresseur de deuxième site extragénique commun, ce qui suggère que les défauts causés par les protéines mutantes sont mécaniquement similaires. Par conséquent, les résidus de glycine peuvent optimiser les contacts ADN-protéine. Les défauts conférés par les substitutions de résidus proline semblent être fondamentalement différents. Les propriétés des particules mutantes ainsi que la structure atomique du virion suggèrent que les résidus de proline peuvent agir pour guider l'ADN emballé vers l'unité asymétrique adjacente liée quintuple, empêchant ainsi un arrangement d'emballage chaotique.


CH450 et CH451 : Biochimie - Définir la vie au niveau moléculaire

7.1 Examen du concept pour les réactions enzymatiques

Définition d'une enzyme

Clivage de liaison homolytique vs hétérolytique

Nucléophiles et électrophiles

Poussée d'électrons

Constantes de dissociation acide, pKa

Classifications des enzymes primaires

7.2 Aperçu des mécanismes catalytiques

Catalyse covalente

Catalyse acide-base

Catalyse électrostatique

Désolvatation

Catalyse par approximation

Catalyse de coenzyme

Distorsion de contrainte

7.3 Exemples de mécanismes de réaction

Protéase Enzymes

NMP Kinases

Endonucléases de restriction

Enzymes à ARN – Ribozymes

7.4 Références

7.1 Examen du concept pour les réactions enzymatiques

Dans cette section, nous passerons en revue certains principes fondamentaux de la chimie organique et biologique qui sont utiles pour comprendre les mécanismes de réaction enzymatique.

Définition d'une enzyme

Rappelez-vous du chapitre 6, que les enzymes sont des catalyseurs biologiques qui réduisent l'énergie d'activation requise pour qu'une réaction se déroule dans le sens direct (figure 7.1). Ils facilitent la formation des espèces à l'état de transition au sein de la réaction et accélèrent la vitesse de réaction d'un million de fois par rapport aux réactions non catalysées. Notez que les enzymes ne modifient PAS le G de la réaction et n'ont AUCUN effet sur la spontanéité ou la position d'équilibre de la réaction. Les enzymes, comme les autres catalyseurs, ne sont pas non plus épuisées pendant la réaction. Les enzymes ont une spécificité de substrat élevée et peuvent même présenter une régiospécificité qui conduit à la génération de produits stéréospécifiques.

Figure 7.1 Effet d'une enzyme sur la réduction de l'énergie d'activation requise pour démarrer une réaction où (a) n'est pas catalysée et (b) est une réaction catalysée par une enzyme.

Clivage de liaison homolytique vs hétérolytique

Clivage du lien, ou scission, est la séparation des liaisons chimiques. Cela peut être généralement appelé dissociation lorsqu'une molécule est clivée en deux fragments ou plus. En général, il existe deux classifications pour le clivage des liaisons : homolytiqueet hétérolytique, selon la nature du processus (Figure 7.2).

Dans clivage hétérolytique, ouhétérolyse, la liaison se brise de telle manière que la paire d'électrons partagée à l'origine reste avec l'un des fragments. Ainsi, un fragment gagne un électron, ayant les deux électrons de liaison, tandis que l'autre fragment perd un électron. [4] Ce processus est également connu sous le nom de fission ionique.

Dans clivage homolytique, ouhomolyse, les deux électrons d'une liaison covalente clivée sont divisés également entre les produits. Ce processus est également connu sous le nom de fission homolytique ou fission radicale.

Figure 7.2 Exemples de clivage de liaison hétérolytique et homolytique. Dans le clivage hétérolytique, les deux électrons partagés sont retenus par l'un des atomes de la liaison partagée, tandis que dans le clivage homolytique, un électron est retenu par chaque atome d'une liaison partagée formant des intermédiaires radicaux.

Nucléophiles et électrophiles

UNE nucléophile est un atome ou un groupe fonctionnel avec une paire d'électrons (généralement une paire non liée ou isolée) qui peut être partagée. La même chose, cependant, peut être dite à propos d'une base : en fait, les bases peuvent agir comme des nucléophiles, et les nucléophiles peuvent agir comme des bases. Quelle est donc la différence entre une base et un nucléophile ?

Une base de Brønsted-Lowry utilise une seule paire d'électrons pour former une nouvelle liaison avec un proton acide. Rappelez-vous que lorsque nous évaluons la basicité – la force d'une base – nous parlons en termes de thermodynamique : où se situe l'équilibre dans une réaction acide-base de référence ?

Figure 7.3 Bases de Brønsted-Lowry. Le diagramme supérieur et le diagramme inférieur montrent les positions d'équilibre des bases fortes et faibles, respectivement.

UNE nucléophile partage sa seule paire d'électrons avec un électrophile – un atome pauvre en électrons autre qu'un hydrogène, généralement un carbone. Lorsque nous évaluons la nucléophilie, nous pensons en termes de cinétique : à quelle vitesse le nucléophile réagit-il avec un électrophile de référence ?

Figure 7.4 Nucléophiles. Les diagrammes supérieur et inférieur montrent respectivement des nucléophiles à réaction plus rapide et à réaction plus lente.

En laboratoire et en chimie organique biologique, les atomes nucléophiles les plus courants sont l'oxygène, l'azote et le soufre, et les composés nucléophiles et les groupes fonctionnels les plus courants sont l'ion eau/hydroxyde, les alcools, les phénols, les amines, les thiols et parfois les carboxylates.

Dans certaines circonstances, les atomes de carbone peuvent également jouer le rôle de nucléophiles. Par exemple, les ions énolates sont des nucléophiles carbonés courants dans les réactions biochimiques, tandis que l'ion cyanure ( C N − ) est un exemple de nucléophile carboné couramment utilisé en laboratoire (figure 7.5).

Figure 7.5 Le carbone peut agir comme un nucléophile dans certaines circonstances.

De nombreuses fonctions enzymatiques exécutées dans les systèmes vivants utilisent des protéines comme catalyseur. Cependant, certaines réactions enzymatiques peuvent être médiées par d'autres macromolécules telles que l'ARN et seront discutées plus en détail à la fin de ce chapitre. Dans les structures protéiques, plusieurs des groupes R d'acides aminés peuvent servir de nucléophiles et se trouvent souvent dans le site actif des enzymes.Ceux-ci comprennent : la cystéine, la sérine, la thréonine, la tyrosine, l'acide glutamique, l'acide aspartique, la lysine, l'arginine et l'histidine (figure 7.6).

Figure 7.6 Groupes R d'acides aminés qui agissent généralement comme un nucléophile. Les acides aminés réactifs, qui peuvent servir de nucléophile, se trouvent souvent dans le site actif des enzymes et participent au mécanisme de réaction.

Poussée d'électrons

Flèche poussant ou poussée d'électrons est une technique utilisée pour décrire la progression des mécanismes réactionnels de la chimie organique. Il a d'abord été développé par Sir Robert Robinson. En utilisant la flèche poussant, “flèches courbes” ou “flèches frisées” sont superposées sur les formules structurelles des réactifs dans une équation chimique pour montrer le mécanisme de réaction. Les flèches illustrent le mouvement des électrons lorsque les liaisons entre les atomes sont rompues et formées. La poussée de flèche est également utilisée pour décrire comment les charges positives et négatives sont distribuées autour des molécules organiques par résonance. Il est important de se rappeler, cependant, que la poussée de flèche est un formalisme et que les électrons (ou plutôt la densité électronique) ne se déplacent pas aussi proprement et discrètement en réalité.

Les chimistes organiques utilisent deux types de flèches dans les structures moléculaires pour décrire les mouvements des électrons. Les trajectoires des électrons simples sont désignées par des flèches à un seul barbelé, tandis que les flèches à double barbelé montrent le mouvement des paires d'électrons (Figure 7.7).

Figure 7.7 Trajectoire des paires d'électrons (diagramme du haut) et trajectoire du mouvement d'un seul électron (diagramme du bas).

Lorsqu'une liaison est rompue, les électrons quittent l'endroit où se trouvait la liaison, ce qui est représenté par une flèche incurvée pointant à l'opposé de la liaison et une flèche pointant vers la prochaine orbitale moléculaire inoccupée. De même, les chimistes organiques représentent la formation d'un lien par une flèche courbe pointant entre deux espèces.

Pour plus de clarté, lorsque vous poussez des flèches, il est préférable de dessiner les flèches en partant d'une seule paire d'électrons ou d'une liaison σ ou et se terminant dans une position pouvant accepter une paire d'électrons, permettant au lecteur de savoir exactement quels électrons se déplacent et où ils se terminent.

Constantes de dissociation acide, Ka et pKa

La définition de Brønsted-Lowry d'un acide est toute espèce qui peut donner un proton, alors qu'une base est toute espèce qui peut accepter un proton. La force d'un acide est mesurée en fonction de son potentiel de dissociation au sein d'une solution et se caractérise par une constante de dissociation acide, Kune, (aussi connu sous le nom constante d'acidité, ou constante d'ionisation acide). Les Ka est une mesure quantitative de la force d'un acide en solution et est la constante d'équilibre pour une réaction chimique

connue sous le nom de dissociation dans le contexte des réactions acido-basiques. L'espèce chimique HA est un acide qui se dissocie en A − , la base conjuguée de l'acide et un ion hydrogène, H + . Le système est dit en équilibre lorsque les concentrations de ses composants ne changeront pas avec le temps, car les réactions avant et arrière se produisent à la même vitesse.

La constante de dissociation est définie par

où les quantités entre crochets représentent les concentrations de l'espèce à l'équilibre.

La constante de dissociation acide est une conséquence directe de la thermodynamique sous-jacente de la réaction de dissociation. Le p Kune La valeur est directement proportionnelle au changement d'énergie libre de Gibbs standard pour la réaction. La valeur du pKune change avec la température et peut être compris qualitativement selon le principe de Le Châtelier, comme suit : lorsque la réaction est endothermique, Kune augmente et p Kune diminue avec l'augmentation de la température, l'inverse est vrai pour les réactions exothermiques. La valeur de pKune dépend également de la structure moléculaire de l'acide.

Le comportement quantitatif des acides et des bases en solution ne peut être compris que si leur pKune les valeurs sont connues. En particulier, le pH d'une solution peut être prédit lorsque la concentration analytique et pKune les valeurs de tous les acides et bases sont connues à l'inverse, il est possible de calculer la concentration à l'équilibre des acides et bases en solution lorsque le pH est connu. Ces calculs trouvent une application dans de nombreux domaines différents de la chimie, de la biologie, de la médecine et de la géologie. Par exemple, de nombreux composés utilisés pour les médicaments sont des acides ou des bases faibles, et une connaissance de la pKune les valeurs, ainsi que le coefficient de partage eau-octanol, peuvent être utilisées pour estimer la mesure dans laquelle le composé pénètre dans la circulation sanguine. Dans les organismes vivants, l'homéostasie acido-basique et la cinétique enzymatique dépendent de la pKune valeurs des nombreux acides et bases présents dans la cellule et dans le corps.

Classifications des enzymes primaires

Rappelez-vous du chapitre 6 qu'il existe six grandes classes de réactions biochimiques qui sont médiées par des enzymes (tableau 7.1). Celles-ci comprennent les réactions d'oxydoréduction, les réactions de transfert de groupe, les réactions d'hydrolyse, la formation/l'élimination de doubles liaisons carbone-carbone, les réactions d'isomérisation et les réactions de ligature. Cette section vous donnera une brève introduction à ces six types de réactions.

Tableau 7.1 Système de classification des enzymes primaires par la Commission des enzymes (CE)

Réactions d'oxydoréduction

Un réaction d'oxydoréduction (redox) est un type de réaction chimique qui implique un transfert d'électrons entre deux atomes ou composés. La substance qui perd les électrons est dite oxydée, tandis que la substance qui gagne les électrons est dite réduite. Redoxles réactions doivent toujours se produire ensemble. Si une molécule est oxydée, alors une autre molécule doit être réduite (c'est-à-dire que les électrons n'apparaissent pas de nulle part pour être ajoutés à un composé, ils doivent toujours provenir de quelque part !).

Le changement de composition électronique peut être évalué dans le changement de la état d'oxydation (ou nombre)d'un atome. Par conséquent, un réaction d'oxydo-réduction est toute réaction chimique dans laquelle l'état d'oxydation (nombre) d'une molécule, d'un atome ou d'un ion change en gagnant ou en perdant un électron. Nous allons apprendre à évaluer l'état d'oxydation d'une molécule dans cette section. Dans l'ensemble, les réactions redox sont courantes et vitales pour certaines des fonctions de base de la vie, notamment la photosynthèse, la respiration, la combustion et la corrosion ou la rouille.

Comme le montre la figure 7.8, un mnémonique simple pour vous aider à vous rappeler quel membre gagne des électrons et quel membre perd des électrons est « LEO le lion dit GER », où LEO signifie Lose Eélectrons = Ooxydé et ALL signifie gain Eélectrons = Rinstruit.

Graphique 7.8. Les règles d'oxydation et de réduction. (Diagramme supérieur) Le mnémonique LEO le lion dit que GER est un moyen utile de se souvenir des principaux concepts des réactions d'oxydation-réduction, notant que lorsqu'une molécule Loses Ec'est Ooxydé (LEO), et lorsqu'une molécule gains Edes électrons c'est Rinstruit (ALL). (Diagramme inférieur) Un exemple de réaction redox avec les composants oxydés et réduits indiqués.

Réactions de transfert de groupe

Dans réactions de transfert de groupe, un groupe fonctionnel sera transféré d'une molécule qui sert de molécule donneuse à une autre molécule qui sera la molécule acceptrice. Le transfert d'une fonction amine d'une molécule à une autre est un exemple courant de ce type de réaction et est illustré à la figure 7.9 ci-dessous.

Figure 7.9 Transfert d'un groupe fonctionnel amine. Une réaction de transfert de groupe courante dans les systèmes biologiques est celle qui est utilisée pour produire des acides -aminés qui peuvent ensuite être utilisés pour la synthèse des protéines. Dans cette réaction, un acide -aminé sert de molécule donneuse et un acide -céto (ces molécules contiennent un groupe fonctionnel acide carboxylique et un groupe fonctionnel cétone séparés par un carbone ) sert d'accepteur. Dans la molécule acceptrice, l'oxygène carbonyle est remplacé par la fonction amine, alors que dans la molécule donneuse, la fonction amine est remplacée par un oxygène formant une nouvelle fonction cétone.

Réactions d'hydrolyse

Le classement de réactions d'hydrolyse comprennent à la fois les réactions directes qui impliquent l'ajout d'eau à une molécule pour la séparer ou la réaction inverse impliquant l'élimination de l'eau pour joindre les molécules, appelées synthèse de déshydratation (ou condensation)(Figure 7.7) .Lorsque de l'eau est ajoutée à une molécule pour la séparer en deux molécules, cette réaction est appelée hydrolyse. Le terme 'lyse‘ signifie se séparer, et le terme 'hydro« fait référence à l’eau. Ainsi, le terme hydrolyse signifie se briser avec de l'eau. L'inverse de cette réaction implique l'élimination de l'eau de deux molécules pour les réunir en une molécule plus grosse. Puisque les deux molécules perdent de l'eau, elles sont déshydraté. Ainsi, la formation de molécules par l'élimination de l'eau est connue sous le nom de synthèse de déshydratation. Étant donné que l'eau est également un sous-produit de ces réactions, elles sont également communément appelées réactions de condensation. Comme nous l'avons vu au chapitre 6, la formation des principales classes de macromolécules dans l'organisme (protéines, glucides, lipides et acides nucléiques) se fait par synthèse de déshydratationoù l'eau est éliminée des molécules (Figure 7.10). Au cours de la digestion normale de nos molécules alimentaires, les principales macromolécules sont décomposées en leurs éléments constitutifs par le processus de hydrolyse.

Figure 7.10 Synthèse d'hydrolyse et de déshydratation. Les réactions d'hydrolyse interviennent dans la décomposition des polymères plus gros en leurs blocs de construction monomères par l'ajout d'eau aux molécules. L'inverse de la réaction est la synthèse par déshydratation, où l'eau est éliminée des blocs de construction monomères pour créer la structure polymère plus grande.

Comme vous l'avez appris tout au long de ce terme, les principales macromolécules sont construites en assemblant des sous-unités monomères répétitives au cours du processus de synthèse par déshydratation. Il est intéressant de noter que les unités fonctionnelles organiques utilisées dans les procédés de synthèse par déshydratation pour chacun des principaux types de macromolécules présentent des similitudes les unes avec les autres. Ainsi, il est utile de regarder les réactions ensemble (Figure 7.11)

Figure 7.11 Réactions de synthèse de déshydratation impliquées dans la formation de macromolécules. Les principales réactions organiques nécessaires à la biosynthèse des lipides, des acides nucléiques (ADN/ARN), des protéines et des glucides sont présentées. Notez que dans toutes les réactions, il existe un groupe fonctionnel qui contient deux groupes électroattracteurs (l'acide carboxylique, l'acide phosphorique et l'hémiacétal ont chacun deux atomes d'oxygène attachés à un atome central de carbone ou de phosphore). Cela forme un atome central réactif partiellement positif (carbone dans le cas de l'acide carboxylique et de l'hémiacétal, ou phosphore dans le cas de l'acide phosphorique) qui peut être attaqué par l'oxygène ou l'azote électronégatif d'une fonction alcool ou amine.

La formation/suppression des doubles liaisons carbone-carbone

Les réactions qui interviennent dans la formation et l'élimination des doubles liaisons carbone-carbone sont également courantes dans les systèmes biologiques et sont catalysées par une classe d'enzymes appelées lyase. La formation ou l'élimination de doubles liaisons carbone-carbone est également utilisée dans les réactions de chimie organique synthétique pour créer les molécules organiques souhaitées. L'un de ces types de réactions est appelé réaction d'hydrogénation, où une molécule d'hydrogène (H2) est ajouté à travers une double liaison C-C, la réduisant à une simple liaison C-C. Si cela est fait en utilisant des huiles insaturées, les graisses insaturées peuvent être converties en graisses saturées (Figure 7.12). Ce type de réaction est couramment effectué pour produire des huiles partiellement hydrogénées en les convertissant de liquides à température ambiante en solides. Les margarines à base d'huile végétale sont fabriquées de cette manière. Malheureusement, un sous-produit de cette réaction peut être la formation de TAGS contenant trans doubles liaisons. Une fois que les dangers pour la santé de la consommation de gras trans ont été reconnus, la Food and Drug Administration (FDA) a interdit l'inclusion de trans graisses dans les produits alimentaires. Cette interdiction a été promulguée à l'été 2015 et a donné trois ans aux fabricants d'aliments pour les éliminer de l'approvisionnement alimentaire, avec une date limite au 18 juin 2018.

Figure 7.12 Hydrogénation des huiles pour produire de la margarine. Les huiles insaturées peuvent être partiellement ou totalement hydrogénées pour produire les acides gras saturés afin de produire des margarines qui resteront solides à température ambiante. L'ajout des nouveaux atomes d'hydrogène pour créer les hydrocarbures saturés est indiqué en jaune dans le produit final.

Photo du haut fournie par Huile de coton et photo du bas fournie par Littlegun

Réactions d'isomérisation

Dans réactions d'isomérisation une seule molécule est réarrangée de telle sorte qu'elle conserve la même formule moléculaire mais a maintenant un ordre de liaison différent des atomes formant un structurel ou un stéréoisomère. La conversion du glucose 6-phosphate en fructose 6-phosphate est un bon exemple de réaction d'isomérisation et est illustrée à la figure 7.13

Figure 7.13 Isomérisation du glucose 6-phosphate en fructose 6-phosphate.

Réactions de ligature

Réactions de ligature utiliser l'énergie de l'ATP pour joindre deux molécules ensemble. Un exemple de ce type de réaction est la jonction de l'acide aminé avec la molécule d'ARN de transfert (ARNt) lors de la synthèse des protéines. Au cours de la synthèse des protéines, les molécules d'ARNt amènent chacun des acides aminés au ribosome où ils peuvent être incorporés dans la séquence protéique nouvellement en croissance. Pour ce faire, les molécules d'ARNt doivent d'abord être attachées à l'acide aminé approprié. Des enzymes spécifiques sont disponibles, appelées amino acyl – ARNt synthétases qui interviennent dans cette réaction. Les enzymes synthétase utilisent l'énergie de l'ATP pour attacher de manière covalente l'acide aminé à la molécule d'ARNt. Un schéma de ce processus est présenté à la figure 7.14. Pour chacun des 20 acides aminés, il existe une molécule d'ARNt spécifique et une enzyme synthétase spécifique qui assureront la fixation correcte du bon acide aminé avec sa molécule d'ARNt.

Figure 7.14 Réaction de ligature Fixation covalente de la méthionine avec l'ARNt approprié. L'enzyme amino-acyl ARNt synthétase pour la méthionine (en bleu) attache de manière covalente la méthionine (rose clair) à la molécule d'ARNt de méthionine (rose foncé). Cette réaction nécessite l'énergie fournie par la décomposition de la molécule d'ATP en AMP, libérant de l'énergie avec la décomposition des liaisons phosphate en deux ions phosphate inorganique (2 Pi).

7.2 Aperçu des mécanismes catalytiques

Les descriptions ci-dessous décrivent les principaux mécanismes utilisés par les enzymes pour catalyser les réactions chimiques. Il convient de noter que de nombreuses enzymes utilisent plus d'une, et parfois plusieurs stratégies catalytiques différentes au cours de leur mécanisme de réaction.

Catalyse covalente

Catalyse covalente implique la formation d'une liaison covalente entre l'enzyme et au moins un des substrats impliqués dans la réaction. Souvent, cela implique catalyse nucléophile qui est une sous-classe de la catalyse covalente. Comme on le voit dans la section 7.1, plusieurs groupes R d'acides aminés peuvent servir de nucléophile et se trouvent souvent sur le site actif des enzymes. Les chaînes latérales nucléophiles sont souvent activées par la déprotonation provoquée par les chaînes latérales voisines, telles que l'histidine qui peut servir de base. Alternativement, l'eau peut également activer le nucléophile. La formation de liaison covalente intermédiaire entre l'enzyme et le substrat permet le clivage de la liaison et l'élimination d'un groupe partant.

Catalyse acide-base

Catalyse acide-base est impliqué dans tout mécanisme réactionnel qui nécessite le transfert d'un proton d'une molécule à une autre. Il est très courant de voir ce mécanisme combiné à la catalyse covalente car de nombreux nucléophiles sont activés par l'élimination d'un proton, notamment les groupes fonctionnels alcool, thiol et amine. Les enzymes qui utilisent la catalyse acide-base peuvent être regroupées en soit acido-basique spécifique ou acido-basique générale réactions. Acide spécifique ou socle spécifique la catalyse se produit si un ion hydronium (H3O + ) ou un ion hydroxyde (OH – ), respectivement, sont utilisés directement dans le mécanisme de réaction, et le pH de la solution affecte le taux de catalyse. Réactions générales acides et générales basiques se produisent lorsque des molécules autres que l'ion hydronium (H3O + ) ou un ion hydroxyde (OH – ) sont à l'origine du don ou de l'acceptation de protons. Le plus souvent, un résidu d'acide aminé de site actif est utilisé pour accepter ou donner un proton dans le mécanisme de réaction. Dans réactions acido-basiques générales le pH est généralement maintenu constant dans un système tamponné.

Catalyse électrostatique

Catalyse électrostatique se produit lorsque le site actif de l'enzyme stabilise l'état de transition de la réaction en formant des interactions électrostatiques avec le substrat. Les interactions électrostatiques peuvent être des interactions ioniques, ioniques-dipôles, dipôles-dipôles ou hydrophobes. La liaison hydrogène est l'une des interactions électrostatiques les plus courantes formées dans le site actif.

Désolvatation

Les sites actifs enzymatiques peuvent devenir dépourvus d'eau et imiter les caractéristiques de réaction de la phase gazeuse. Cela peut déstabiliser l'état polarisé des groupes chargés tels que les acides et les bases. Ainsi, la forme neutre de ces types de résidus devient l'état privilégié. Ceci est dû à des altérations significatives du pKa des résidus du site actif dans l'environnement non polaire. Cela peut amener des résidus normalement acides tels que le glutamate à extraire un proton de l'histidine et à se comporter comme une base, par exemple.

Catalyse par approximation

En catalyse par approximation, l'enzyme améliore la vitesse de réaction en se liant à plusieurs substrats et en les positionnant favorablement pour que la réaction puisse se dérouler. La liaison avec l'enzyme réduit l'entropie rotationnelle des substrats qui autrement flotteraient librement en solution de manière aléatoire, et permet le positionnement correct des substrats pour la réaction. La perte d'entropie, qui n'est pas favorable, est compensée par l'énergie de liaison libérée avec l'interaction substrat-enzyme.

En plus de positionner correctement les substrats pour interagir les uns avec les autres, la catalyse par approximation convertit une réaction qui aurait été du second ordre, avec des substrats flottant librement en solution, en une réaction de premier ordre, où tous les substrats sont maintenus en place par l'enzyme et se comportent comme une seule molécule. Cela peut améliorer considérablement la vitesse catalytique de la réaction de 10 5 à 10 7 fois plus rapide, selon le système enzymatique.

Distorsion de contrainte

En chimie organique, vous avez appris que certaines structures telles que les structures cycliques à trois et quatre chaînons, telles que les époxydes, étaient très réactives en raison de la distorsion de contrainte inhérente aux angles de liaison défavorables inhérents au cycle. Les sites actifs enzymatiques peuvent également utiliser la distorsion de contrainte au sein d'un substrat lié pour augmenter la réactivité de la molécule et favoriser la formation de l'état de transition. De nombreuses enzymes qui fonctionnent selon le modèle d'ajustement induit utilisent également une distorsion de contrainte au sein de leur mécanisme catalytique.A l'état non lié, ils restent dans un état catalytique faible, cependant l'interaction avec le substrat induit la déstabilisation du site actif de l'enzyme ou peut induire une contrainte au sein du substrat provoquant l'initiation de l'activité catalytique de l'enzyme.

Catalyse de cofacteur

Cofacteurs sont des molécules qui se lient aux enzymes et sont nécessaires à l'activité catalytique de l'enzyme. Ils peuvent être divisés en deux grandes catégories : métaux et coenzymes. Cofacteurs métalliques qui se trouvent couramment dans les enzymes humaines comprennent : le fer, le magnésium, le manganèse, le cobalt, le cuivre, le zinc et le molybdène. Coenzymes sont de petites molécules organiques qui sont souvent dérivées de vitamines, qui sont des nutriments organiques essentiels consommés dans l'alimentation. Coenzymes peuvent se lier de manière lâche à l'enzyme et ont la capacité de se lier et de se libérer du site actif, ou ils peuvent être étroitement liés et ne pas avoir la capacité de se libérer facilement de l'enzyme. Les coenzymes à liaison étroite sont appelées groupes prothétiques. Les enzymes qui ne sont pas encore associées à un cofacteur requis sont appelées apoenzymes, tandis que les enzymes liées à leurs cofacteurs requis sont appelées holoenzymes.Parfois, des molécules organiques et des métaux se combinent pour former des coenzymes, comme dans le cas du cofacteur de l'hème (Figure 7.15). La coordination des cofacteurs de l'hème avec leurs homologues enzymatiques implique souvent des interactions électrostatiques avec des résidus d'histidine, comme le montre l'enzyme succinate déshydrogénase illustrée à la figure 7.15.

Figure 7.15 Le cofacteur hème. La famille des cofacteurs de l'hème contient un métal de fer coordonné avec une structure en anneau de porphyrine comme indiqué dans le panneau de gauche dans la structure de l'hème B. Dans le panneau de droite, l'hème B est représenté complexé avec l'enzyme succinate déshydrogénase du cycle de Kreb.

La structure de l'hème B montrée dans le panneau de gauche provient de : Yikrazuul et la structure cristalline de la succinate déshydrogénase complexée avec l'hème B provient de : Richard Wheeler.

Comme exemple de la façon dont les vitamines peuvent être utilisées comme cofacteurs, le tableau 7.2 montre les vitamines B courantes et les coenzymesdérivés de leurs structures. De nombreuses carences en vitamines provoquent des états pathologiques dus à l'inactivité des apoenzymes qui sont incapables de fonctionner sans le correctement lié coenzyme.

Tableau 7.2 Vitamines B essentielles et leurs cofacteurs enzymatiques modifiés

Cofacteurs peut aider à médier les réactions enzymatiques grâce à l'utilisation de l'une des différentes stratégies catalytiques énumérées ci-dessus. Ils peuvent servir de nucléophiles et médier la catalyse covalente ou former des interactions électrostatiques avec le substrat et stabiliser l'état de transition. Ils peuvent également provoquer une déformation de contrainte ou faciliter la catalyse acide-base. La catalyse assistée par métal peut souvent utiliser des mécanismes de réaction homolytique qui impliquent des intermédiaires radicalaires. Cela peut être important dans des réactions telles que celles qui se produisent dans la chaîne de transport d'électrons qui nécessitent le mouvement sûr d'électrons uniques.

7.3 Exemples de mécanismes de réaction

Protéase Enzymes

Les enzymes protéolytiques (également appelées peptidases, protéases et protéinases) sont capables d'hydrolyser les liaisons peptidiques dans les protéines. Ils peuvent être trouvés dans tous les organismes vivants, des virus aux animaux et aux humains. Les enzymes protéolytiques ont une grande importance médicale et pharmaceutique en raison de leur rôle clé dans les processus biologiques et dans le cycle de vie de nombreux agents pathogènes. Les protéases sont des enzymes largement appliquées dans plusieurs secteurs de l'industrie et de la biotechnologie. De plus, de nombreuses applications de recherche nécessitent leur utilisation, notamment la production de fragments de Klenow, la synthèse de peptides, la digestion de protéines indésirables lors de la purification des acides nucléiques, la culture cellulaire et la dissociation des tissus, la préparation d'anticorps recombinants. fragments pour la recherche, le diagnostic et la thérapie, et l'exploration des relations structure-fonction.

Les enzymes protéolytiques appartiennent à la classe des hydrolases et sont regroupées dans la sous-classe des hydrolases peptidiques ou peptidases. Selon le site d'action enzymatique, les protéases peuvent également être subdivisées en exopeptidases ou endopeptidases. Les exopeptidases, telles que les aminopeptidases et les carboxypeptidases, catalysent l'hydrolyse des liaisons peptidiques près des extrémités N – ou C -terminales du substrat, respectivement (Figure 7.16). Les endopeptidases (figure 7.16) clivent les liaisons peptidiques à des emplacements internes au sein de la séquence peptidique. Les proteases peuvent également être non spécifiques et cliver toutes les liaisons peptidiques de manière égale ou elles peuvent être hautement spécifiques de séquence et ne cliver les peptides qu'après certains résidus ou dans des séquences localisées spécifiques.

Figure 7.16 Réactions peptidiques courantes. Les aminopeptidases (diagramme du haut) et les carboxypeptidases (diagramme du milieu) éliminent les résidus d'acides aminés terminaux, tandis que les endopeptidases (diagramme du bas) clivent les séquences protéiques au niveau des sites internes. Les flèches rouges montrent les liaisons peptidiques à cliver.

L'action des enzymes protéolytiques est essentielle dans de nombreux processus physiologiques. Par exemple, les protéases fonctionnent dans la digestion des protéines alimentaires, le renouvellement des protéines, la division cellulaire, la cascade de la coagulation sanguine, la transduction du signal, le traitement des hormones polypeptidiques, l'apoptose et le cycle de vie de plusieurs organismes pathogènes, y compris la réplication de rétrovirus tels que comme le virus de l'immunodéficience humaine (VIH). En raison de leur rôle clé dans le cycle de vie de nombreux hôtes et agents pathogènes, ils ont une grande importance médicale, pharmaceutique et académique.

Il a été estimé précédemment qu'environ 2% des gènes humains codent pour des enzymes protéolytiques et en raison de leur nécessité dans de nombreux processus biologiques, les protéases sont devenues des cibles thérapeutiques importantes. Ils sont intensément étudiés pour explorer leurs relations structure-fonction, pour étudier leurs interactions avec les substrats et les inhibiteurs, pour développer des agents thérapeutiques pour les thérapies antivirales ou pour améliorer leur thermostabilité, leur efficacité et pour changer leur spécificité par génie protéique à des fins industrielles ou thérapeutiques.

Sur la base du mécanisme catalytique et de la présence de résidus d'acides aminés au site actif, les protéases peuvent être regroupées en protéases aspartiques, protéases à cystéine, protéases glutamiques, métalloprotéases, asparagine protéases, sérine protéases, thréonine protéases et protéases à mélange ou mécanisme catalytique inconnu. Ici, nous allons explorer le mécanisme de réaction et la spécificité de séquence de la famille des protéases à sérine.

La liste des protéases à sérine est assez longue. Ils sont regroupés en deux grandes catégories : 1) ceux qui sont de type chymotrypsine et 2) ceux qui sont de type subtilisine. Bien que les enzymes de type subtilisine et de type chymotrypsine utilisent le même mécanisme d'action, y compris la triade catalytique, les enzymes ne sont par ailleurs pas liées les unes aux autres par séquence et semblent avoir évolué indépendamment (figure 7.17). Ils sont donc un exemple de évolution convergente – un processus où l'évolution de différentes formes converge vers une structure pour fournir une fonction commune.

Figure 7.17 Évolution convergente des protéases à sérine, chymotrypsine et subtilisine. La structure cristalline de l'eucaryote, la chymotrypsine bovine (panneau de gauche) avec la triade catalytique indiquée en vert. La structure cristalline de la subtilisine procaryote BPN de la bactérie Bacillus subtilis (panneau de droite) avec la triade catalytique et les mutations communes indiquées à l'aide des modèles de balle et de bâton. Notez que la formation de la triade catalytique est étonnamment similaire entre les deux structures, alors que les structures protéiques environnantes et la séquence ne présentent pas d'homologie ou d'ascendance apparentée.

Image de chymotrypsine bovine modifiée de Mattyjenjen et image de subtilisine BNP de Romero-Garcia, E.R., et al. (2009) J Biomed Biotech 2009(1):201075

Les enzymes sérine protéase de type chymotrypsine clivent la liaison peptidique du côté acide carboxylique d'acides aminés spécifiques et la spécificité est déterminée par la taille/forme/charge de la chaîne latérale d'acides aminés qui s'insère dans la poche de liaison S1 de l'enzyme (Figure 7.18). Trois membres de la famille de type chymotrypsine qui partagent une homologie de séquence élevée sont les enzymes digestives pancréatiques, la trypsine, la chymotrypsine et l'élastase. Les sites de clivage des protéines de ces enzymes varient. La trypsine clive les protéines du côté carboxylique des résidus basiques, tels que la lysine et l'arginine, tandis que la chymotrypsine clive après les acides aminés hydrophobes aromatiques, tels que la phénylalanine, la tyrosine et le tryptophane, et l'élastase clive après les petits résidus hydrophobes, tels que la glycine, l'alanine, et valine. Comme le montre la figure 7.18, les variations des résidus d'acides aminés dans la poche de liaison de ces protéases, permettent des interactions électrostatiques avec le substrat et déterminent la spécificité de séquence.

Figure 7.18 Spécificité du substrat de la trypsine, de la chymotrypsine et de l'élastase. Les panneau supérieur montre les structures cristallines remplissant l'espace de la trypsine, de la chymotrypsine et de l'élastase, respectivement, avec la poche de liaison au substrat S1 indiquée. Les panneau inférieur décrit les domaines de liaison SI de chaque protéase plus en détail avec les groupes R d'acides aminés importants indiqués. Pour la trypsine, un résidu d'aspartate dans la partie inférieure de la poche S1 aide aux interactions électrostatiques avec les résidus basiques du substrat. La poche de liaison de la chymotrypsine S1 est grande et de nature hydrophobe, contenant des résidus aromatiques du substrat, tandis que la poche de liaison de l'élastase S1 est petite et hydrophobe, ne permettant qu'à d'autres groupes R petits et hydrophobes de s'arrimer à cet endroit.

Les protéases à sérine utilisent quatre des principaux mécanismes catalytiques au cours du cycle de réaction : la catalyse acide-base, la catalyse covalente, les interactions électrostatiques et la désolvatation. Le site actif des protéases à sérine contient une triade catalytique de trois acides aminés : His, Ser (d'où le nom « serine protéase » 8221) et Asp. Ces trois acides aminés clés jouent chacun un rôle essentiel dans la capacité de clivage des protéases. Alors que les membres acides aminés de la triade sont situés loin les uns des autres dans la séquence primaire de la protéine, en raison du repliement, ils seront très proches les uns des autres au cœur de l'enzyme.

Lors d'un événement de catalyse, un mécanisme ordonné se produit dans lequel plusieurs intermédiaires sont générés. La catalyse du clivage peptidique peut être considérée comme un catalyse ping-pong, dans lequel un substrat se lie (dans ce cas, le polypeptide étant clivé), un produit est libéré (l'extrémité N-terminale "la moitié" du peptide), un autre substrat se lie (dans ce cas, l'eau), et un autre produit est libéré (l'extrémité C-terminale “la moitié” du peptide). La figure 7.19 détaille le processus catalytique.

Dans les étapes 1 à 2, le substrat polypeptidique pénètre dans le site actif et est positionné dans la bonne orientation près du résidu sérine du site actif à travers interactions électrostatiques dans la poche de fixation S1. Le carbone carbonyle du substrat est positionné à proximité du résidu sérine du site actif. L'hydrogène de l'alcool à sérine est extrait par le résidu histidine catalytique à travers catalyse acido-basique.Ceci est rendu possible par l'action du résidu aspartate du site actif. Dans ce cas, le résidu aspartate extrait un proton de l'histidine, permettant à l'histidine d'éliminer le proton de l'alcool sérine. Normalement, ce serait une chose étrange que l'aspartate puisse faire, car le pKa du groupe R de l'aspartate est beaucoup plus faible que celui de l'histidine dans un environnement aqueux. Cependant, lorsque le substrat peptidique s'ancre dans le site actif de l'enzyme, cela exclut l'eau de la zone à travers un désolvatationprocessus et crée un microenvironnement hydrophobe. Cela augmente effectivement la pKa d'aspartate et favorise la forme non chargée ou protonée du résidu, provoquant l'abstraction de protons de l'histidine.

Aux étapes 2 à 3 catalyse covalente est activé car la sérine du site actif médie l'attaque nucléophile sur le carbone carbonyle du substrat formant un intermédiaire oxyanion tétraédrique. L'intermédiaire oxyanion dans la voie est ensuite stabilisé par des interactions électrostatiques avec une région de la protéase connue sous le nom de trou oxyanion. Ici, la charge négative de l'oxyanion est stabilisée par interactions électrostatiques avec les azotes d'amide du squelette de la protéase. Le rebond de l'oxyanion pour reformer la double liaison carbonyle conduit au clivage de la liaison peptidique. La partie C-terminale de la protéine peut alors quitter le site actif de l'enzyme.

Une fois que le peptide C-terminal quitte le site actif, l'eau peut entrer et réhydrater le site actif, comme vu dans les étapes 5 à 6. Une molécule d'eau est orientée à proximité du carbone carbonyle du peptide N-terminal qui est toujours lié à le résidu sérine du site actif. L'oxygène de l'eau agit comme un nucléophile et attaque le carbone carbonyle, recréant un intermédiaire oxyanion qui est stabilisé par le interactions électrostatiques du trou d'oxyanion. Lorsque cet oxyanion rebondit pour reformer le carbonyle, le résidu sérine agit comme un groupe partant et le peptide N-terminal est libéré de l'enzyme. La présence d'eau dans le site actif rétablit le résidu sérine et les états natifs des résidus histidine et acide aspartique.

Dans l'ensemble, chaque acide aminé de la triade effectue une tâche spécifique dans ce processus :

  • La sérine a un groupe -OH qui est capable d'agir comme un nucléophile, attaquant le carbone carbonyle de la liaison peptidique scissile du substrat (catalyse covalente).
  • Une paire d'électrons sur l'azote de l'histidine a la capacité d'accepter l'hydrogène du groupe sérine -OH, coordonnant ainsi l'attaque de la liaison peptidique (catalyse acide/base).
  • Le groupe carboxyle sur l'acide aspartique se coordonne à son tour avec l'histidine, ce qui rend l'atome d'azote mentionné ci-dessus beaucoup plus électronégatif grâce au processus de désolvatation.

Interactions électrostatiques sont essentiels pour (1) lier le substrat dans la poche de liaison S1 (2) stabiliser l'oxyanion à l'état de transition et (3) coordonner la molécule d'eau pour médier l'attaque nucléophile sur l'intermédiaire lié à l'enzyme.

Figure 7.19 Mécanisme de réaction des protéases de type chymotrypsine. Le mécanisme de réaction a été décomposé en un processus en huit étapes. Dans les étapes 1 à 3, le substrat protéique se lie à la protéase et est orienté pour placer le carbone carbonyle du substrat à proximité du résidu sérine du site actif. La catalyse acide-base permet l'activation du résidu sérine pour médier l'attaque nucléophile sur le substrat protéique. L'intermédiaire oxyanion covalent montré en 3 et 4 est stabilisé par le trou oxyanion. Le rebond des électrons pour reformer le groupe carbonyle provoque le clivage de la liaison peptidique et l'élimination de la partie C-terminale du peptide du site actif, illustré en 5. L'eau pénètre dans le site actif et intervient dans l'attaque nucléophile du carbone carbonyle. de l'intermédiaire enzyme-substrat, comme indiqué en 6 et 7. Au fur et à mesure que la liaison carbonyle se reforme, la sérine agit comme un groupe partant et le peptide N-terminal est libéré de l'enzyme. La triade catalytique dans le site actif de l'enzyme est récupérée et l'enzyme est réinitialisée pour un autre cycle d'activité catalytique, comme indiqué en 8.

Adénylate Kinases

Adénylate kinase (aussi connu sous le nom AK ou myokinase) est une enzyme phosphotransférase qui catalyse l'interconversion des nucléotides d'adénine (ATP, ADP et AMP). En surveillant en permanence les niveaux de nucléotides phosphates à l'intérieur de la cellule, les enzymes AK jouent un rôle important dans l'homéostasie énergétique cellulaire. La réaction chimique de base médiée par cette classe d'enzymes est la conversion de 2 molécules d'ADP en 1 ATP et 1 AMP (Figure 7.20A). La réaction inverse peut également se produire en formant un équilibre basé sur les concentrations cellulaires des divers états de phosphorylation.

À ce jour, neuf isoformes de protéine AK humaine ont été identifiées. Alors que certains d'entre eux sont omniprésents dans tout le corps, certains sont localisés dans des tissus spécifiques. Par exemple, AK7 et AK8 ne se trouvent que dans le cytosol des cellules et AK7 se trouve dans le muscle squelettique alors que AK8 ne l'est pas. Non seulement les emplacements des diverses isoformes au sein de la cellule varient, mais la liaison du substrat à l'enzyme et la cinétique du transfert de phosphoryle sont également différentes. AK1, l'isozyme AK cytosolique le plus abondant, a un Km environ mille fois plus élevé que le Km de AK7 et 8, indiquant une liaison beaucoup plus faible de AK1 à l'AMP. La localisation sous-cellulaire des enzymes AK est effectuée par des séquences de ciblage uniques trouvées dans la protéine. Chaque isoforme a également une préférence différente pour les NTP’. Certains n'utiliseront que l'ATP, tandis que d'autres accepteront le GTP, l'UTP et le CTP comme transporteur de phosphoryle.

Les enzymes AK peuvent être impliquées dans la régulation des concentrations de nucléotides et servir de système de relais entre les pools cellulaires et mitochondriaux de nucléotides d'adénine, comme le montre la figure 7.20B. Les enzymes AK peuvent également servir de capteur pour la charge énergétique dans la cellule et peuvent conduire à l'activation de systèmes sensibles à l'AMP dans la cellule lorsque les niveaux d'énergie sont faibles (Figure 7.20C).

Graphique 7.20. Activité enzymatique adénylate kinase (AK). (A) La réaction fondamentale des AMP Kinases. (B) les réactions des enzymes AK peuvent fonctionner dans des mécanismes en cascade pour fournir une signalisation et une communication entre différentes régions de la cellule, y compris le cytoplasme et les mitochondries, et (C) les enzymes AK sont souvent utilisées comme moniteur métabolique de la charge énergétique, conduisant à la l'activation ou l'inhibition des enzymes en aval.

Le transfert de phosphoryle au cours de la réaction AK ne se produit qu'après la fermeture d'une structure à "couvercle ouvert" dans l'enzyme à travers le catalyse par approximation mécanisme (figures 7.21 et 7.22). Cela provoque une exclusion des molécules d'eau qui rapproche les substrats les uns des autres et abaisse efficacement la barrière énergétique pour l'attaque nucléophile par le groupe -phosphoryle de l'ATP sur le -phosphoryle de l'AMP. Dans la structure cristalline de l'enzyme AK de E. coli avec l'inhibiteur Ap5A (figure 7.21C), le résidu Arg88 coordonne l'Ap5A au niveau du groupe α-phosphate à travers interactions électrostatiques. Il a été montré que la mutation de Arg88 en Gly (R88G) entraîne une perte de 99% de l'activité catalytique de cette enzyme, suggérant que ce résidu est intimement impliqué dans le transfert de phosphoryle. Un autre résidu hautement conservé est Arg119, qui se trouve dans la région de liaison à l'adénosine de l'AK et agit pour prendre en sandwich l'adénine dans le site actif. Il a été suggéré que la promiscuité de ces enzymes dans l'acceptation d'autres NTP est due à ces interactions relativement sans conséquence de la base dans la poche de liaison à l'ATP. Un réseau de résidus positifs conservés (Lys13, Arg123, Arg156 et Arg167 dans AK de E. coli) stabilisent l'accumulation de charge négative sur le groupe phosphoryle pendant le transfert. Deux résidus d'aspartate distaux se lient au réseau d'arginine, provoquant le repliement de l'enzyme et réduisant sa flexibilité. UNE magnésiumcofacteur est également nécessaire, indispensable pour augmenter l'électrophilie du phosphate sur l'AMP, bien que cet ion magnésium ne soit retenu dans la poche active que par des interactions électrostatiques et se dissocie facilement.

La flexibilité et la plasticité permettent aux protéines de se lier à des ligands, de former des oligomères, de s'agréger et d'effectuer un travail mécanique. Les grands changements de conformation des protéines jouent un rôle important dans la signalisation cellulaire. L'AK agit comme une protéine de transduction de signal ainsi, l'équilibre entre les conformations régule l'activité de la protéine. AK a une conformation ‘open’ (Figure 7.21A) qui est induite dans la conformation ‘closed’ et biologiquement active lors de la liaison au substrat.

Figure 7.21 Structure cristalline de l'enzyme adénylate kinase. Structures des états ouvert (A, PDB ID : 4AKE) et fermé (B, PDB ID : 1AKE). Les domaines LID et NMP sont indiqués respectivement en rouge et en orange. Le domaine CORE et le reste de la protéine sont représentés en bleu. (C) Image PDB 3HPQ montrant le squelette de l'enzyme AK dans le dessin animé et les résidus clés sous forme de bâtonnets et étiquetés en fonction de leur placement dans le E. coli Enzyme AK, cristallisée avec un inhibiteur d'Ap5A.

Les deux sous-domaines (LID et NMP) peuvent se replier et se déplier indépendamment l'un de l'autre en fonction de la liaison au substrat. La liaison au substrat induit des changements régionaux dans la structure de la protéine vers les conformations partiellement fermées ou complètement fermées. La conformation entièrement fermée optimise l'alignement des substrats pour le transfert de phosphoryle et facilite l'élimination de l'eau du site actif pour éviter une hydrolyse inutile de l'ATP.

Figure 7.22 Voie de transition conformationnelle et mécanisme catalytique proposé de l'AK. Modèle a, AK sans substrat avec une conformation ouverte. Modèle b, forme d'ADK liée à l'ATP avec un domaine LID fermé. Modèle c, forme liée à l'ATP et à l'AMP d'AK avec une conformation fermée. Modèle d, deux formes de AK liées à l'ADP avec une conformation fermée. Modèle e, une forme d'AK liée à l'ADP avec un domaine NMP fermé.

Endonucléases de restriction

UNE Enzyme de restriction, endonucléase de restriction, ou restreindreest une enzyme qui clive l'ADN en fragments au niveau ou à proximité de sites de reconnaissance spécifiques au sein de molécules connues sous le nom de sites de restriction. Les enzymes de restriction sont une classe du groupe plus large d'enzymes endonucléases. Les enzymes de restriction sont généralement classées en cinq types, qui diffèrent par leur structure et selon qu'elles coupent leur substrat d'ADN au niveau de leur site de reconnaissance, ou si les sites de reconnaissance et de clivage sont séparés les uns des autres. Pour couper l'ADN, toutes les enzymes de restriction font deux incisions, une fois à travers chaque squelette sucre-phosphate (c'est-à-dire chaque brin) de la double hélice d'ADN. Ici, nous nous concentrerons sur les enzymes de restriction de type II qui sont couramment utilisées dans les applications de biologie moléculaire et de biotechnologie.

Comme avec d'autres classes d'enzymes de restriction, les enzymes de restriction de type II se produisent exclusivement dans les formes de vie microbiennes unicellulaires - principalement les bactéries et les archées (procaryotes) - et on pense qu'elles fonctionnent principalement pour protéger ces cellules des virus et autres molécules d'ADN infectieuses. A l'intérieur d'un procaryote, les enzymes de restriction découpent sélectivement étranger ADN dans un processus appelé digestion de restriction pendant ce temps, l'ADN de l'hôte est protégé par une enzyme de modification (une méthyltransférase) qui modifie l'ADN procaryote et bloque le clivage. Ensemble, ces deux processus forment le système de modification des restrictions.

La première enzyme de restriction de type II découverte était HindII de la bactérie Haemophilus influenzae Rd. L'événement a été décrit par Hamilton Smith (Figure 7.23) dans sa conférence Nobel, prononcée le 8 décembre 1978 :

«Dans l'une de ces expériences, nous avons utilisé de l'ADN marqué du phage P22, un virus bactérien avec lequel j'avais travaillé pendant plusieurs années avant de venir à Hopkins. À notre grande surprise, nous n'avons pas pu récupérer l'ADN étranger des cellules. Avec le récent rapport de Meselson dans nos esprits, nous avons immédiatement soupçonné qu'il pourrait subir une restriction, et notre expérience avec la viscométrie nous a dit que ce serait un bon test pour une telle activité. Le lendemain, deux viscosimètres ont été installés, l'un contenant de l'ADN P22 et l'autre Haemophilus ADN. Un extrait cellulaire a été ajouté à chacun et nous avons commencé à prendre rapidement des mesures. Au fur et à mesure que l'expérience progressait, nous sommes devenus de plus en plus excités à mesure que la viscosité de les Haemophilus L'ADN est resté stable tandis que la viscosité de l'ADN P22 a diminué. Nous étions convaincus d'avoir découvert une nouvelle enzyme de restriction hautement active. De plus, il semblait ne nécessiter que du Mg 2+ comme cofacteur, ce qui suggère qu'il s'avérerait être une enzyme plus simple que celle de E. coli K ou B.

Après plusieurs faux départs et de nombreuses heures fastidieuses avec notre test au viscosimètre laborieux mais sensible, Wilcox et moi avons réussi à obtenir une préparation purifiée de l'enzyme de restriction. Nous avons ensuite utilisé la centrifugation en gradient de saccharose pour montrer que l'enzyme purifiée se dégradait sélectivement ADN P22 duplex, mais pas simple brin, en fragments d'une longueur moyenne d'environ 100 pb, tandis que Haemophilus L'ADN présent dans le même mélange réactionnel n'a pas été touché. Aucun nucléotide libre n'a été libéré pendant la réaction, ni n'a pu nous détectons toute entaille dans les produits d'ADN. Ainsi, l'enzyme était clairement une endonucléase qui produisait des cassures double brin et était spécifique de l'ADN étranger. Étant donné que les produits de digestion finaux (limites) de l'ADN étranger sont restés importants, il nous a semblé que le clivage doit être site-spécifique. Cela s'est avéré être le cas et nous avons pu le démontrer directement en séquençant les extrémités des fragments de clivage.

Graphique 7.23. Hamilton Smith et Daniel Nathans lors de la conférence de presse du prix Nobel, le 12 octobre 1978 (reproduit avec la permission de Susie Fitzhugh). Dépôt d'origine : Archives médicales Alan Mason Chesney, collection Daniel Nathans.

Les enzymes de restriction sont nommées selon la taxonomie de l'organisme dans lequel elles ont été découvertes. La première lettre de l'enzyme fait référence au genre de l'organisme et la deuxième et la troisième à l'espèce. Ceci est suivi de lettres et/ou de chiffres identifiant l'isolat. Les chiffres romains sont utilisés pour spécifier différentes enzymes d'un même organisme. Par exemple, l'enzyme « HindIII » a été découverte dans Haemophilus influenzae, sérotype d, et est distincte des endonucléases HindI et HindII également présentes au sein de cette bactérie. Les ADN-méthyltransférases (MTases) qui accompagnent les enzymes de restriction sont nommées de la même manière et reçoivent le préfixe « M. ». Lorsqu'il y a plus d'une MTase, elles sont préfixées « M1 », « M2 », etc.

Les enzymes de restriction qui reconnaissent la même séquence d'ADN, quel que soit l'endroit où elles se coupent, sont appelées « isoschizomères » (iso = égal skhizo = divisé). Isoschizomères qui coupent la même séquence à différentes positions sont encore appelés « néoschizomères » (néo = nouveau). Isoschizomères qui coupent à la même position sont fréquemment, mais pas toujours, des versions dérivées de l'évolution de la même enzyme (par exemple BamHI et OkrAI). néoschizomères, d'autre part, il s'agit souvent d'enzymes non liées à l'évolution (par exemple EcoRII et MvaI).

Les enzymes de restriction de type II sont un conglomérat de nombreuses protéines différentes qui, par définition, ont la capacité commune de cliver l'ADN duplex à une position fixe à l'intérieur ou à proximité de leur séquence de reconnaissance. Ce clivage génère des fragments d'ADN reproductibles et des modèles d'électrophorèse sur gel prévisibles, propriétés qui ont fait de ces enzymes des réactifs inestimables pour la manipulation et l'investigation de l'ADN en laboratoire. Presque toutes les enzymes de restriction de type II nécessitent des cations divalents, habituellement Mg 2+ , en tant que composants essentiels de leurs sites catalytiques. Le Ca2+, d'autre part, agit souvent comme un inhibiteur des enzymes de restriction de type II.

Les séquences de reconnaissance des enzymes de restriction de type II sont palindromedans la nature, avec deux types possibles de séquences palindromiques. Les palindrome miroir est similaire à ceux trouvés dans le texte ordinaire, dans lequel une séquence se lit de la même manière en avant et en arrière sur un seul brin d'ADN, comme dans GTAATG. Les palindrome répété inversé est également une séquence qui lit les mêmes avant et arrière, mais les séquences avant et arrière se trouvent dans des brins d'ADN complémentaires (c'est-à-dire d'ADN double brin), comme dans GTATAC (GTATAC étant complémentaire de CATATG). Palindromes répétés inversés sont plus fréquents et ont une plus grande importance biologique que palindromes en miroir.La position du clivage au sein de la séquence palindromique peut varier en fonction de l'enzyme et peut produire soit des séquences en surplomb simple brin (extrémités cohésives) soit des produits d'ADN à extrémités franches.

L'enzyme de restriction EcoRI produit des extrémités cohésives :

tandis que le clivage de l'enzyme de restriction SmaI produit des extrémités franches :

La méthylation peut être utilisée par l'hôte pour protéger son propre génome du clivage. Par exemple, la méthylation de la séquence de reconnaissance EcoRI par la méthyltransférase M.EcoRI (MTase), change la séquence de GAATTC en GAm6ATTC (m6A = N6-méthyladénine). Cette modification protège complètement la séquence du clivage par EcoRI.

Les enzymes de restriction de type II se lient initialement de manière non spécifique à l'ADN et procèdent à un glissement vers le bas du balayage de l'ADN pour les séquences de reconnaissance (figure 7.24). Lors de la liaison à la séquence palindromique correcte, l'enzyme s'associe au cofacteur métallique et médie le clivage catalytique de l'ADN en utilisant le mécanisme de déformation de déformationet catalyse par approximation.

Figure 7.24 Reconnaissance et clivage de l'ADN par des endonucléases de restriction de type II. (A) Vue illustrée d'un dimère EcoRV balayant de manière non spécifique le long de l'ADN jusqu'à ce qu'un site de liaison spécifique soit reconnu. Cela provoque un couplage avec le cofacteur métallique et une distorsion de déformation de l'ADN. L'hydrolyse de la liaison phosphodiester est médiée et les produits de clivage de l'ADN sont libérés de l'enzyme. (B) montre un modèle de remplissage d'espace de reconnaissance et de clivage de l'ADN EcoRV.

L'une des questions les plus importantes concernant le mécanisme catalytique d'une hydrolase est de savoir si l'hydrolyse implique un intermédiaire covalent, comme cela est typique pour les protéases décrites précédemment. Ceci peut être décidé en analysant le cours stéréochimique de la réaction. Cela a été fait d'abord pour EcoRI, et plus tard pour EcoRV. Les deux enzymes clivent la liaison phosphodiester avec inversion de la stéréoconfiguration au niveau du phosphore, ce qui plaide contre la formation d'un intermédiaire covalent enzyme-ADN. Ainsi, il est proposé que le clivage implique l'attaque nucléophile directe du substrat par une molécule d'eau, comme le montre la figure 7.25.

Figure 7.25 Un mécanisme général pour le clivage de l'ADN par EcoRI et EcoRV. Une molécule d'eau activée attaque le phosphore en ligne avec la liaison phosphodiester à cliver, ce qui procède par inversion de configuration. X, Y et Z sont respectivement une base générale, un acide de Lewis et un acide général.

Les enzymes de restriction de type II forment généralement un homodimère lorsqu'elles se lient à l'ADN, comme le montre la structure cristalline de BglII dans la figure 7.26B. BglII catalyse le clivage de la liaison phosphodiester au niveau du squelette de l'ADN par le biais d'un transfert de phosphoryle dans l'eau. Des études sur le mécanisme des enzymes de restriction ont révélé plusieurs caractéristiques générales qui semblent être vraies dans presque tous les cas, bien que le mécanisme réel pour chaque enzyme soit très probablement une variation de ce mécanisme général (Figure 7.25). Ce mécanisme nécessite une base pour générer l'ion hydroxyde à partir de l'eau, qui agira comme le nucléophile et attaquera le phosphore dans la liaison phosphodiester. Un acide de Lewis est également requis pour stabiliser la charge négative supplémentaire du phosphore à l'état de transition pentacoordonné, ainsi qu'un acide général ou un ion métallique qui stabilise le groupe partant (3'-0 - ). Dans certaines enzymes de restriction de type II, deux cofacteurs métalliques divalents sont nécessaires (comme dans EcoRV et BamHI), tandis que d'autres enzymes ne nécessitent qu'un seul cofacteur métallique divalent (comme dans EcoRI et BglII).

Des études structurales d'endonucléases ont révélé une architecture similaire pour le site actif avec les résidus suivant la séquence consensus faible Glu/Asp-(X)9-20-Glu/Asp/Ser-X-Lys/Glu. BglII’s site actif est similaire à d'autres endonucléases’, suivant la séquence Asp-(X)9-Glu-X-Gln. Dans son site actif se trouve un cation métallique divalent, très probablement Mg 2+ , qui interagit avec Asp-84, Val-94, un oxygène phosphoryle et trois molécules d'eau. L'une de ces molécules d'eau est capable d'agir comme un nucléophile en raison de sa proximité avec le groupe phosphoryle scissile (figure 7.26A). La molécule d'eau nucléophile est positionnée pour attaquer le groupe phosphoryle par une liaison hydrogène avec la chaîne latérale amide oxygène de Gln-95 et son contact avec le cation métallique. L'interaction avec le cation métallique abaisse efficacement son pKune, favorisant la nucléophilie de l'eau (Figure 7.26 A). Au cours de l'hydrolyse, le cation divalent est capable de stabiliser le groupe partant 3′-O – et de coordonner l'abstraction de protons à partir de l'une des molécules d'eau coordonnées (figure 7.26A).

Figure 7.26 Mécanisme de réaction proposé pour l'endonucléase de restriction de type II, BglII. (A) Diagramme schématique du mécanisme catalytique démontrant l'utilité des ions Mg2 + et des résidus d'acides aminés polaires au sein du site actif pour activer et positionner une molécule d'eau pour une attaque nucléophile sur la liaison phosphodiester du substrat d'ADN. (B) Structure cristalline du dimère BglII avec ADN double brin et (C) Coordination du cofacteur Mg2+ au sein du site actif de l'enzyme BglII.

Ribozymes

Ribozymes (riboacide nucléique frzymes) sont des molécules d'ARN qui ont la capacité de catalyser des réactions biochimiques spécifiques, y compris l'épissage de l'ARN dans l'expression des gènes, similaire à l'action des enzymes protéiques. En 1982, l'intron auto-épissé du groupe I a été signalé comme le premier ARN catalytique découvert. Il a été décrit chez les protozoaires ciliés Tetrahymena thermofila par Sidney Altman et Thomas Czech, qui ont reçu le prix Nobel de chimie en 1989. Des introns similaires peuvent être trouvés dans certains génomes procaryotes et dans les mitochondries et l'ADN chloroplastique de divers eucaryotes. Le deuxième exemple de ribozyme à découvrir était la RNAse P impliquée dans la maturation de l'ARNt, qui avait un rôle biologique clé et une occurrence ubiquitaire à la fois chez les procaryotes et les eucaryotes. Le troisième ARN catalytique signalé était un petit ribozyme (

50 nt), le ribozyme marteau auto-clivant (HHR), qui a été trouvé dans un groupe de pathogènes végétaux atypiques avec de petits génomes à ARN circulaire (circRNA) tels que les ARN satellites viraux et les viroïdes. Depuis lors, quelques autres exemples de ribozymes naturels ou artificiels ont été découverts, y compris le ribosome, un ARN catalytique singulier qui catalyse la formation de liaisons peptidiques, la réaction chimique centrale dans la biologie existante. Ce paysage soutient fortement l'hypothèse d'un monde à ARN prébiotique, où les premiers organismes auto-répliquants étaient basés sur l'ARN à la fois comme matériel génétique et comme catalyseur. Alors que les protéines modernes auraient remplacé la plupart de ces anciens ARN catalytiques, certains d'entre eux sont restés dans les organismes actuels remplissant différentes fonctions. Parmi tous les ribozymes connus, il y a la famille énigmatique des petits (<200 nt) ARN auto-clivants, qui catalysent une simple transestérification intramoléculaire d'une manière hautement spécifique à la séquence. Cette réaction, qui peut se produire spontanément dans l'ARN, commence par un SNAttaque nucléophile de type 2 de l'oxygène 2′ au 3′-phosphate adjacent, entraînant le clivage de la liaison phosphodiester pour former un phosphate 2′-3′-cyclique et des produits d'ARN 5′-hydroxyle (Figure 7.27A) .

Figure 7.27 Le ribozyme Hammerhead. (UNE) Mécanisme de réaction de transestérification interne dans l'ARN. La réaction de clivage se déroule avec une attaque de la fraction hydroxyle en 2′ au groupe phosphate en 3′, suivie d'un état de transition bipyramidal. Les produits de clivage sont un phosphate 2'-3'-cyclique au niveau du produit d'ARN 5' et un 5'-hydroxyle au niveau du produit d'ARN 3' (B) Schéma du ribozyme marteau. Les cases noires indiquent les nucléotides hautement conservés au cœur catalytique. Structures secondaires de (C) Structure tridimensionnelle du ribozyme Hammerhead.

Semblables aux protéines ribonucléases telles que la RNAse A, les petits ribozymes auto-clivants stabilisent la formation de l'état de transition oxyphosphorane bipyramidal grâce à différentes stratégies catalytiques, telles que l'orientation atomique en ligne, la neutralisation électrostatique et la catalyse acide-base générale. De cette façon, les ribozymes nucléolytiques sont capables de catalyser le clivage de l'ARN à une vitesse seulement quelques fois plus lente que leurs homologues protéiques. Au moins neuf classes de petits ribozymes auto-clivants naturels ont été décrites jusqu'à présent : le marteau (figure 7.27C), l'épingle à cheveux, l'hépatite-δ humaine, le Varkud-satellite, le GlmS, le twister, le twister sister, la hachette et le pistolet ribozymes. Depuis sa découverte il y a 30 ans, le HHR a été largement utilisé comme ribozyme modèle pour des études structurelles, biochimiques et biologiques. Il est composé d'un centre catalytique comprenant 15 nucléotides hautement conservés entourés de trois doubles hélices (I à III), qui adoptent une structure secondaire qui ressemble à la forme d'une tête de requin marteau. Selon l'hélice ouverte, il existe trois formes possibles de permutation circulaire, nommées de type I, II ou III (Figure 7.27B). Le motif HHR, comme d'autres petits ribozymes tels que l'épingle à cheveux et l'hépatite-δ, a été historiquement considéré comme une particularité biologique des génomes à ARN circulaire subviral. Cependant, nous savons maintenant que de petits ARN catalytiques tels que le HHR peuvent se produire en grand nombre dans les génomes à ADN des bactéries aux eucaryotes, y compris notre propre génome, et effectuer diverses fonctions biologiques que nous commençons tout juste à reconnaître.

Le ribosome fonctionne également comme un ribozyme qui médie la formation de la liaison amide pendant la synthèse des protéines. La synthèse des protéines à partir d'une matrice d'ARNm se produit sur un ribosome, une nanomachine composée de protéines et d'ARN ribosomiques (ARNr). Le ribosome est composé de deux très grandes unités structurelles qui sont un amalgame de protéines et de molécules d'ARNr (figure 7.28). La plus petite unité (appelée 30S et 40S chez les bactéries et les eucaryotes, respectivement) coordonne l'appariement correct des bases du codon triplet sur l'ARNm avec un autre petit ARN adaptateur, transfert ou ARNt, qui apporte un acide aminé connecté de manière covalente au site.

Figure 7.28 La petite sous-unité ribosomique de Thermus thermophilus. L'ARN ribosomique 16S est représenté en orange avec les protéines ribosomiques attachées en bleu.

La formation de liaison peptidique se produit lorsqu'une autre molécule d'ARNt-acide aminé se lie à un codon adjacent sur l'ARNm. L'ARNt a une structure tertiaire en feuille de trèfle avec une certaine structure secondaire à liaison H intrabrin. Les trois derniers nucléotides à l'extrémité 3 & 8242 de l'ARNt sont CpCpA. L'acide aminé est estérifié au terminal 3’OH du terminal A par une enzyme protéique, l'aminoacyl-ARNt synthétase.

La formation d'une liaison amide covalente entre le deuxième acide aminé et le premier, formant un dipeptide, se produit au centre de la peptidyl transférase, situé sur la plus grande sous-unité ribosomique (50S et 60S chez les bactéries et les eucaryotes, respectivement). Le ribosome abaisse l'ARNm de sorte que le dipeptide-ARNt se trouve maintenant sur le site P ou Peptide, en attendant un nouvel ARNt-acide aminé sur le site A ou Amino. La figure 7.29 montre un schéma du ribosome avec un ARNm lié sur la sous-unité 30S et des ARNt liés de manière covalente à un acide aminé (ou au peptide en croissance) aux sites A et P, respectivement.

Figure 7.29 Représentation schématique d'un ribosome bactérien. Les sous-unités 50 (jaune) et 30 (bleu) du ribosome sont composées de protéines et d'ARNr. L'ARNm (brin linéaire rouge) est montré amarré sur la sous-unité 30s. Les sites P et A sont remplis de molécules d'ARNt (vert et rouge).

Un mécanisme probable pour la formation de la liaison amide entre un peptide en croissance sur l'ARNt du site P et l'acide aminé sur l'ARNt du site A a été dérivé de structures cristallines avec des substrats liés et des analogues d'état de transition et est illustré à la figure 7.30. La catalyse n'implique aucune des protéines ribosomiques (non représentées) car aucune n'est suffisamment proche du centre peptidyl transférase pour fournir des acides aminés qui pourraient participer à la catalyse acide/base générale. Par conséquent, l'ARNr doit agir comme l'enzyme (c'est-à-dire qu'il s'agit d'un ribozyme). Initialement, on pensait qu'une adénosine proximale avec un pKa perturbé pouvait, à pH physiologique, être protonée/déprotonée et donc agir comme un acide/base général dans la réaction. Cependant, aucun n'a été trouvé. Le mécanisme le plus probable pour stabiliser l'état de transition oxyanion sur le site d'attaque du carbone électrophile est précisément l'eau localisée, qui est positionnée au niveau du trou oxyanion par des liaisons H à l'uracile 2584 sur l'ARNr. Le mécanisme de clivage fait intervenir le brassage concerté de protons illustré à la figure 7.30. Dans ce mécanisme, le substrat (peptide-ARNt) assiste son propre clivage en ce que le 2’OH est en position d'initier le mécanisme de navette protéique. (Un mécanisme similaire pourrait se produire pour faciliter l'hydrolyse de la protéine complètement allongée de l'ARNt du site P.) Bien sûr, tout cela nécessite un positionnement parfait des substrats et n'est-ce pas ce que les enzymes font le mieux ? Les principaux mécanismes de catalyse de la formation de liaisons peptidiques par le ribosome (en tant que ribozyme) sont la catalyse intramoléculaire et la stabilisation de l'état de transition par la molécule d'eau positionnée de manière appropriée.

Figure 7.30 Mécanisme de formation de liaison peptidique. La formation de liaisons peptidiques est probablement médiée par un mécanisme de navette protonique qui est stabilisé par une molécule d'eau coordonnée dans le trou d'oxyanion.

La structure cristalline du ribosome eucaryote a été récemment publiée (Ben-Shem et al). Il est significativement plus grand (40%) que son homologue procaryote, avec une masse d'environ 3吆 6 Daltons. La sous-unité 40S a une chaîne d'ARNr (18S) et 33 protéines associées, tandis que la plus grande sous-unité 60S a 3 chaînes d'ARNr (25S, 5.8S et 5S) et 46 protéines associées. La plus grande taille du ribosome eucaryote facilite davantage d'interactions avec les protéines cellulaires et une plus grande régulation des événements cellulaires. La structure d'un ribosome eucaryote 80S montrant des interactions d'ARNr et de protéines est illustrée à la figure 7.31.

Figure 7.31 Ribosome eucaryote 80S. La sous-unité 40S est à gauche, la sous-unité 60S à droite. Le noyau d'ARN ribosomique (ARNr) est représenté par un tube gris, les segments d'expansion sont indiqués en rouge. Les protéines universellement conservées sont indiquées en bleu. Ces protéines ont des homologues chez les eucaryotes, les archées et les bactéries. Les protéines partagées uniquement entre les eucaryotes et les archées sont indiquées en orange, et les protéines spécifiques aux eucaryotes sont indiquées en rouge. Identifiants PDB 4a17, 4A19, 2XZM alignés sur 3U5B, 3U5C, 3U5D, 3U5E


Contrôle du métabolisme par la régulation enzymatique

Les cellules régulent leurs processus biochimiques en inhibant ou en activant des enzymes.

Objectifs d'apprentissage

Expliquer l'effet d'une enzyme sur l'équilibre chimique

Points clés à retenir

Points clés

  • Dans l'inhibition compétitive, une molécule inhibitrice entre en compétition avec un substrat en se liant au site actif de l'enzyme, de sorte que le substrat est bloqué.
  • Dans l'inhibition non compétitive (également connue sous le nom d'inhibition allostérique), un inhibiteur se lie à un site allostérique, le substrat peut toujours se lier à l'enzyme, mais l'enzyme n'est plus en position optimale pour catalyser la réaction.
  • Les inhibiteurs allostériques induisent un changement de conformation qui modifie la forme du site actif et réduit l'affinité du site actif de l'enzyme pour son substrat.
  • Les activateurs allostériques induisent un changement de conformation qui modifie la forme du site actif et augmente l'affinité du site actif de l'enzyme pour son substrat.
  • L'inhibition de la rétroaction implique l'utilisation d'un produit de réaction pour réguler sa propre production ultérieure.
  • Les cofacteurs inorganiques et les coenzymes organiques favorisent une orientation et une fonction optimales des enzymes.
  • Les vitamines agissent comme des coenzymes (ou précurseurs des coenzymes) et sont nécessaires au fonctionnement des enzymes.

Mots clés

  • coenzyme: Molécule organique nécessaire au fonctionnement d'une enzyme.
  • site allostérique: Un site autre que le site actif sur une enzyme.
  • cofacteur: Molécule inorganique nécessaire au fonctionnement d'une enzyme.

Contrôle du métabolisme par la régulation enzymatique

Les besoins et les conditions cellulaires varient d'une cellule à l'autre et changent au sein des cellules individuelles au fil du temps. Par exemple, une cellule de l'estomac nécessite une quantité d'énergie différente de celle d'une cellule de la peau, d'une cellule de stockage de graisse, d'une cellule sanguine ou d'une cellule nerveuse. La même cellule de l'estomac peut également avoir besoin de plus d'énergie immédiatement après un repas et de moins d'énergie entre les repas.

La fonction d'une cellule est encapsulée par les réactions chimiques qu'elle peut effectuer. Les enzymes abaissent les énergies d'activation des réactions chimiques dans les cellules, elles favorisent les réactions spécifiques à la fonction cellulaire. Parce que les enzymes déterminent en fin de compte les réactions chimiques qu'une cellule peut effectuer et la vitesse à laquelle elles peuvent se dérouler, elles sont la clé de la fonctionnalité cellulaire.

Inhibition compétitive et non compétitive

La cellule utilise des molécules spécifiques pour réguler les enzymes afin de favoriser ou d'inhiber certaines réactions chimiques. Parfois, il est nécessaire d'inhiber une enzyme pour réduire une vitesse de réaction, et cette inhibition peut se produire de plusieurs manières. Dans l'inhibition compétitive, une molécule inhibitrice est suffisamment similaire à un substrat pour qu'elle puisse se lier au site actif de l'enzyme pour l'empêcher de se lier au substrat. Il est en concurrence avec le substrat pour se lier à l'enzyme.

Dans l'inhibition non compétitive, une molécule inhibitrice se lie à l'enzyme à un emplacement autre que le site actif (un site allostérique). Le substrat peut toujours se lier à l'enzyme, mais l'inhibiteur modifie la forme de l'enzyme de sorte qu'elle n'est plus en position optimale pour catalyser la réaction.

Inhibition enzymatique: L'inhibition compétitive et non compétitive affecte la vitesse de réaction différemment. Les inhibiteurs compétitifs affectent le taux initial, mais n'affectent pas le taux maximal, alors que les inhibiteurs non compétitifs affectent le taux maximal.

Inhibition et activation allostériques

Dans l'inhibition allostérique non compétitive, les molécules inhibitrices se lient à une enzyme au niveau du site allostérique. Leur liaison induit un changement de conformation qui réduit l'affinité du site actif de l'enzyme pour son substrat. La liaison de cet inhibiteur allostérique modifie la conformation de l'enzyme et de son site actif, de sorte que le substrat n'est pas capable de se lier. Cela empêche l'enzyme d'abaisser l'énergie d'activation de la réaction et la vitesse de réaction est réduite.

Cependant, les inhibiteurs allostériques ne sont pas les seules molécules qui se lient aux sites allostériques. Les activateurs allostériques peuvent augmenter les taux de réaction. Ils se lient à un site allostérique qui induit un changement de conformation qui augmente l'affinité du site actif de l'enzyme pour son substrat. Cela augmente la vitesse de réaction.

Inhibiteurs et activateurs allostériques: Les inhibiteurs allostériques modifient le site actif de l'enzyme de sorte que la liaison au substrat soit réduite ou empêchée. En revanche, les activateurs allostériques modifient le site actif de l'enzyme de sorte que l'affinité pour le substrat augmente.

Cofacteurs et Coenzymes

De nombreuses enzymes ne fonctionnent que si elles sont liées à des molécules auxiliaires non protéiques appelées cofacteurs et coenzymes. La liaison à ces molécules favorise une conformation et une fonction optimales de leurs enzymes respectives. Ces molécules se lient temporairement par des liaisons ioniques ou hydrogène ou de façon permanente par des liaisons covalentes plus fortes.

Les cofacteurs sont des ions inorganiques tels que le fer (Fe 2+ ) et le magnésium (Mg 2+ ). Par exemple, l'ADN polymérase nécessite un ion zinc (Zn 2+ ) pour construire des molécules d'ADN. Les coenzymes sont des molécules auxiliaires organiques avec une structure atomique de base composée de carbone et d'hydrogène. Les coenzymes les plus courantes sont les vitamines alimentaires. La vitamine C est une coenzyme pour plusieurs enzymes qui participent à la construction du collagène, un composant important du tissu conjonctif. La pyruvate déshydrogénase est un complexe de plusieurs enzymes qui nécessite un cofacteur et cinq coenzymes organiques différentes pour catalyser sa réaction chimique. La disponibilité de divers cofacteurs et coenzymes régule la fonction enzymatique.

Vitamines: Les vitamines sont des coenzymes importantes ou des précurseurs de coenzymes et sont nécessaires au bon fonctionnement des enzymes. Les gélules multivitaminées contiennent généralement des mélanges de toutes les vitamines à des pourcentages différents.

Compartimentation enzymatique

Dans les cellules eucaryotes, les molécules telles que les enzymes sont généralement compartimentées en différents organites. Cette organisation contribue à la régulation enzymatique car certains processus cellulaires sont contenus dans des organites séparés. Par exemple, les enzymes impliquées dans les étapes ultérieures de la respiration cellulaire effectuent des réactions exclusivement dans les mitochondries. Les enzymes impliquées dans la digestion des débris cellulaires et des matières étrangères sont situées dans les lysosomes.

Inhibition de la rétroaction dans les voies métaboliques

L'inhibition de la rétroaction se produit lorsqu'un produit de réaction est utilisé pour réguler sa propre production ultérieure. Les cellules ont évolué pour utiliser la rétro-inhibition pour réguler l'activité enzymatique dans le métabolisme, en utilisant les produits des réactions enzymatiques pour inhiber une activité enzymatique supplémentaire. Les réactions métaboliques, telles que les processus anaboliques et cataboliques, doivent se dérouler selon les exigences de la cellule. Afin de maintenir l'équilibre chimique et de répondre aux besoins de la cellule, certains produits métaboliques inhibent les enzymes de la voie chimique tandis que certains réactifs les activent.

La rétro-inhibition: Les voies métaboliques sont une série de réactions catalysées par de multiples enzymes. L'inhibition de la rétroaction, où le produit final de la voie inhibe une étape antérieure, est un mécanisme de régulation important dans les cellules.

La production d'acides aminés et de nucléotides est contrôlée par rétro-inhibition. Pour un exemple de rétro-inhibition, considérons l'ATP. C'est le produit du métabolisme catabolique du sucre (respiration cellulaire), mais il agit également comme un régulateur allostérique pour les mêmes enzymes qui l'ont produit. L'ATP est une molécule instable qui peut se dissocier spontanément en ADP si trop d'ATP était présent, la majeure partie serait gaspillée. Cette rétro-inhibition empêche la production d'ATP supplémentaire s'il est déjà abondant. Cependant, alors que l'ATP est un inhibiteur, l'ADP est un activateur allostérique. Lorsque les niveaux d'ADP sont élevés par rapport aux niveaux d'ATP, l'ADP déclenche le catabolisme du sucre pour produire plus d'ATP.



Commentaires:

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