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Efficacité de l'isolement d'ADN plasmidique à partir de cultures de cellules E. coli congelées

Efficacité de l'isolement d'ADN plasmidique à partir de cultures de cellules E. coli congelées


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Quelqu'un a-t-il isolé de l'ADN plasmidique à partir de cultures de cellules E. coli congelées (à -20 degrés) (pas de culots) ? Cela a-t-il fonctionné et si oui, avec quels rendements ? Quelle serait la qualité de l'ADN plasmidique isolé s'il était exécuté sur un gel ? La majeure partie serait-elle dégradée ou intacte ?


Je l'ai fait et cela fonctionne sans aucun problème. Nous avons récolté les cultures au moment optimal (densité), puis les avons congelées pour faire des maxipreps plus tard. Par conséquent, nous avons simplement décongelé la culture, fait en sorte qu'elle ne devienne pas trop chaude (c'est-à-dire que nous avons travaillé sur de la glace), puis nous avons simplement suivi le protocole maxiprep. Aucun problème de rendement ou de qualité du plasmide.

Ce que je ferai la prochaine fois, c'est de faire tourner la culture et de la reprendre au maximum. 50 ml de milieu avant congélation. De cette façon, la congélation sera plus rapide ainsi que la décongélation. J'ai également fait des minipreps à partir de cultures mères (stocks de glycérol de plasmides dans E. coli) qui sont restées accidentellement hors du congélateur pendant deux jours. Ici, les rendements n'étaient pas si élevés (mais la densité de la culture était également beaucoup plus faible), mais la qualité après la miniprep standard était bonne et les plasmides fonctionnaient à la fois pour le clonage ultérieur ainsi que pour la retransformation pour créer de nouveaux stocks.


Une méthode simple et efficace de clonage d'ADN sans soudure utilisant SLiCE de Escherichia coli souches de laboratoire et son application à la mutagenèse dirigée SLiP

L'extrait de clonage par ligature sans soudure (SLiCE) est une méthode simple et efficace pour l'assemblage d'ADN qui utilise des extraits cellulaires du Escherichia coli Souche PPY, qui exprime les composants du système de recombinaison Rouge/ET du prophage . Cette méthode facilite le clonage d'ADN sans site de clivage par endonucléase de restriction en effectuant une recombinaison entre de courts segments d'ADN homologue (≥15 paires de bases).

Résultats

Pour étendre la polyvalence de ce système, j'ai examiné si, en plus des extraits bactériens de la souche PPY, d'autres E. coli les souches de laboratoire étaient adaptées au protocole SLiCE. En effet, des extraits cellulaires soigneusement préparés de plusieurs souches présentaient une activité de clonage suffisante pour une incorporation de gènes transparente dans des vecteurs avec de courtes longueurs d'homologie (environ 15 à 20 pb). En outre, SLiCE a été appliqué à la méthode de mutagenèse dirigée basée sur la réaction en chaîne par polymérase (PCR), dans un processus appelé « mutagenèse dirigée par PCR basée sur SLiCE (mutagenèse dirigée SLiP) ». La mutagenèse dirigée SLiP simplifie les étapes de la mutagenèse dirigée par PCR, car elle exploite la capacité de la méthode SLiCE à insérer plusieurs fragments.

Conclusion

SLiCE peut être effectué en laboratoire sans avoir besoin d'un E. coli souche, et la technique est facilement établie. Cette méthode augmente l'efficacité du clonage, raccourcit le temps de manipulation de l'ADN et réduit considérablement le coût du clonage d'ADN sans couture.


Comment : obtenir de meilleurs rendements de midiprep de plasmide

Je reçois de nombreuses personnes qui se plaignent de la faible production d'ADN des kits de préparation de plasmides plasmidiques commerciaux. Dans cet article, je vais expliquer les principaux pièges de l'isolement des plasmides et comment les éviter.

Bien préparer la culture

Vous obtiendrez toujours les meilleurs résultats en prenant soin de préparer la culture. L'inoculation à partir d'anciennes colonies ou le fait de laisser la culture devenir trop saturée entraînera une mauvaise réplication et rétention du plasmide, ce qui pourrait gravement affecter le rendement. Dans le passé, mes cultures midiprep faisaient pousser pendant la nuit de sorte qu'elles étaient complètement saturées le matin, mais depuis que je suis passé à la procédure suivante, mes rendements se sont considérablement améliorés :

  • Commencez par un Frais colonie, pas plus de quelques jours.
  • Inoculer une culture de démarrage LB de 5 ml avec la colonie le matin et faire croître jusqu'à ce que la DO600 soit d'environ 1, puis conserver au réfrigérateur pendant la nuit.
  • Si vous utilisez l'ampicilline comme vecteur de sélection, placez les cellules en boulettes et remettez-les en suspension dans un milieu frais sans antibiotique pour éliminer la bêta-lactamase sécrétée.
  • Le lendemain matin, inoculer une culture LB de 100 ml avec 1 ml de la culture de démarrage pour les plasmides à nombre de copies élevé, doubler les volumes pour les plasmides à faible copie.
  • Cultivez la culture jusqu'à ce que la DO600 soit d'environ 3, puis agglomérez les cellules et passez directement à la miniprep, ou congelez les cellules à -2o°C et continuez plus tard.

Faire la lyse et la neutralisation complète

La plus grosse erreur que les gens commettent dans les midipreps est le mélange dans les étapes de lyse et de neutralisation. Les protocoles soulignent normalement l'importance d'être doux pour éviter le cisaillement de l'ADN génomique, mais je trouve que les gens ont tendance à être trop doux. Un autre problème courant est que la lyse a duré trop longtemps, ce qui a entraîné une dénaturation permanente de l'ADN non digestible. Voici comment j'aborde la lyse et la neutralisation :


Introduction

Les techniques de génie génétique dérivées de répétitions palindromiques courtes et régulièrement espacées (CRISPR) et de nucléases Cas ont révolutionné l'édition du génome dans un large éventail d'organismes. Les applications CRISPR les plus courantes et les plus réussies concernent l'ingénierie du génome et la régulation des gènes. Les systèmes CRISPR pour l'ingénierie du génome se composent de deux composants clés : une nucléase Cas (par exemple, Cas9 et Cas12a/Cpf1) et une matrice CRISPR de séquences d'ADN répétées et d'espacement alternées (examinées par Jiang et Marraffini, 2015b). La puce CRISPR est transcrite comme un long précurseur, qui est ensuite traité par clivage dans les régions répétées pour produire des ARN CRISPR spécifiques à la cible (ARNcr), qui dirigent la nucléase Cas vers des cibles d'ADN double brin complémentaires (ADNdb), où le La nucléase Cas crée une cassure double brin (DSB). La réparation recombinante naturelle ou dirigée de ce DSB peut entraîner des modifications dans l'ADNdb cible.

Pour les systèmes CRISPR de type II (par exemple CRISPR-Cas9), le crRNA est combiné à un ARN trans-activant (tracrRNA) pour produire un ARN guide (gRNA). Ce système a été manipulé pour permettre la conception d'un seul petit ARN guide (sgRNA), qui contient à la fois le gRNA et le tracrRNA comme un seul transcrit, sans qu'il soit nécessaire de traiter le crRNA par des enzymes Cas accessoires (Jinek et al., 2012 ). Dans le cas des systèmes CRISPR-Cas12a (type V), la Cas12a est une nucléase à double fonction qui traite l'ARNcr et clive les cibles d'ADNdb, ne nécessitant aucune protéine Cas accessoire (Fonfara et al., 2016). En créant de novo petits ARN guides (sgRNA) ou puces CRISPR, les utilisateurs peuvent cibler le clivage du génome sur n'importe quelle séquence contenant le motif adjacent de protospacer (PAM) de 3 à 4 pb en modifiant la ou les régions d'espacement. La fourniture d'ADN de donneur défini par l'utilisateur (ADNd), partageant une homologie avec le site de clivage, dans des cellules compétentes pour la recombinaison, permet la réparation de la cassure de l'ADNdb, en remplaçant la séquence cible par l'ADNd dans le processus (Jiang et al., 2015a ). Sans réparation, la cellule mourra, permettant une méthode de sélection « vivant-mort » (Jiang et al., 2015a Cui et Bikard, 2016 ). L'édition du génome CRISPR présente des avantages majeurs par rapport aux méthodes conventionnelles, notamment des protocoles rapides, une édition sans cicatrice, aucune exigence de marqueurs de sélection et la possibilité d'une édition multiplexée (Jiang et al., 2015a Ao et al., 2018 ).

CRISPRi est un développement ultérieur de la technologie CRISPR pour la régulation des gènes, dans laquelle des mutants de nucléase « morts » (par exemple dCas9 ou ddCpf1) sont utilisés (Qi et al., 2013 Fontana et al., 2018 ). Les nucléases mortes conservent leur capacité de liaison à l'ADN et peuvent être ciblées sur des cadres de lecture ouverts (ORF) ou des régions promotrices, où elles bloquent allostériquement la transcription, entraînant un silence transcriptionnel des gènes (Qi et al., 2013 ). Cela offre des avantages par rapport à la technologie knock-out basée sur CRISPR, notamment la capacité de cibler des gènes essentiels (Wiktor et al., 2016 Rousset et al., 2018 ), accordabilité (Fontana et al., 2018 ) et le multiplexage (Zetsche et al., 2017 Zhang et al., 2017 ) sur des systèmes à base de plasmides. Ces propriétés font de CRISPRi une technologie de régulation génique très puissante, mais simple, rapide et rentable.

Les avantages les plus spectaculaires des technologies CRISPR ont été réalisés dans les organismes eucaryotes, en particulier les cellules de mammifères. En revanche, l'absorption des systèmes bactériens, y compris Escherichia coli, a été limitée, peut-être parce que de nombreux systèmes d'ingénierie efficaces existent déjà pour les bactéries utilisant des phages et des transposons (Hayes, 2003 Akhverdyan et al., 2011 ), ou recombineering (Yoon et al., 1998 ), et les obstacles techniques découragent l'adoption de nouvelles techniques.

Depuis la démonstration de la fonction CRISPR-Cas, plusieurs systèmes ont été décrits pour une utilisation dans E. coli édition du génome (Li et al., 2015 Pyné et al., 2015 Jiang et al., 2015a Ao et al., 2018 ) et CRISPRi (Wu et al., 2015 Kim et al., 2016 Li et al., 2016 Wiktor et al., 2016 Yan et al., 2017 Zhang et al., 2017 Dwidar et Yokobayashi, 2019 Roghanien et al., 2019 ). À ce jour, bon nombre des publications clés en E. coli Les recherches CRISPR décrivent les mécanismes par lesquels la technologie fonctionne ou le développement d'outils pour créer des knock-outs de gènes ou de petites intégrations ou CRISPRi. Nous et d'autres n'avons pas trouvé simple d'adopter certaines de ces méthodes et nous décrivons donc ici de nouveaux plasmides CRISPR-Cas12a, à la fois pour l'édition du génome, y compris l'intégration de grands fragments d'ADN au génome, et CRISPRi dans E. coli ainsi que des protocoles détaillés pour leur modification et leur mise en œuvre faciles. Nous envisageons une large application et une conception claire et des protocoles de laboratoire faciliteront l'adoption de cette technologie transformatrice dans n'importe quel laboratoire.


Améliorer les milieux de culture

Passer à un support plus riche ou ajouter des suppléments peut améliorer votre densité cellulaire, conduisant à un meilleur rendement en ADN plasmidique. Les conditions de culture jouent un rôle essentiel dans le rendement en ADN plasmidique. Différents plasmides et souches varieront dans leurs conditions de croissance optimales. Pour de nombreux plasmides à copie élevée, le bouillon LB standard et les concentrations d'antibiotiques fonctionneront très bien, cependant, pour les plasmides à faible copie ou les souches à croissance plus lente, un changement de milieu peut être avantageux.

Réduire la concentration d'antibiotiques

Les plasmides à faible nombre de copies produisent moins de transcrits de leurs gènes de résistance aux antibiotiques et peuvent donc être cultivés dans des milieux contenant la moitié de la concentration d'antibiotiques normalement recommandée.

Ajouter des suppléments aux médias

Vous pouvez obtenir une densité cellulaire plus élevée en utilisant un bouillon riche en nutriments tel que Terrific Broth, 2xYT, ou un home-brew optimisé pour les rendements en plasmides (par exemple H15). Enrichir vos supports avec des suppléments tels que des sels de magnésium, des agents tampons et/ou fournir des sources de carbone supplémentaires telles que le glycérol ou le glucose (avec modération) peut également servir à augmenter la densité cellulaire et le rendement plasmidique.

Commencez avec une seule colonie fraîche

La sous-culture directement à partir d'un stock de glycérol congelé ou d'un coup de gélose peut entraîner la perte du plasmide, et l'utilisation de plaques plus anciennes peut augmenter la perte ou la mutation du plasmide.


Introduction

Les progrès récents dans le développement de la vaccination par ADN et de la thérapie génique montrent un grand potentiel pour le traitement de la maladie. Comme l'application clinique de ces technologies nécessitera de grandes quantités d'ADN plasmidique au niveau du milligramme, il existe une demande accrue pour de grandes quantités d'ADN plasmidique recombinant 1,2. Ainsi, le développement d'un protocole à grande échelle, reproductible et rentable pour la préparation d'ADN plasmidique est maintenant l'une des tâches les plus difficiles dans le développement de vaccins à ADN 3,4,5.

Les séquences d'ADN cibles peuvent être amplifiées pour produire de grandes quantités d'ADN purifié à utiliser dans des applications telles que la thérapie génique par ligature dans un vecteur plasmidique, qui peut ensuite être transformé en cellules bactériennes appropriées. Ces souches bactériennes recombinantes répliqueront le plasmide, produisant de grandes quantités de l'ADN cible 6 . Un processus typique de génération d'ADN plasmidique comprend la construction et la sélection de vecteurs d'expression appropriés, la production de micro-organismes recombinants et la croissance cellulaire, suivies de la lyse des cellules, et l'extraction et la purification de l'ADN plasmidique 7 . Lorsque les plasmides sont extraits et purifiés, ils se présentent généralement sous l'une des deux formes suivantes : soit en cercle ouvert, soit en super-enroulé. Cependant, lorsqu'ils sont utilisés en thérapie génique ou en immunisation vaccinale, le plasmide sous la forme superenroulée est préféré. Lors de l'extraction de l'ADN plasmidique, l'étape de lyse des cellules bactériennes sans perte de plasmides est probablement la plus critique pour le traitement en aval 8, car la quantité d'ADN plasmidique récupéré est principalement déterminée par cette étape après fermentation 9,10.

L'extraction d'ADN plasmidique à partir de cellules bactériennes commence généralement par une étape de lyse chimique 6, telle que la lyse alcaline 11, qui est une méthode largement adoptée dans les laboratoires de recherche. Cependant, lors de la lyse alcaline, il se forme des précipités qui contiennent des débris cellulaires, des protéines dénaturées et des acides nucléiques qu'il faut éliminer. La centrifugation sur un rotor à angle fixe est l'opération la plus courante au cours de ce processus 12,13 et est une étape limitant la vitesse pour une préparation à grande échelle 14 . Une méthode alternative est la lyse par ébullition, dans laquelle le traitement thermique à 100 ° C interrompt et oblige les cellules à libérer l'ADN plasmidique 15 . Bien que la lyse par ébullition puisse isoler plus de plasmides que la lyse alcaline, le rendement et la pureté des plasmides incohérents, ainsi que la difficulté de fonctionnement, rendent cette méthode indésirable même pour les préparations à l'échelle de la recherche en laboratoire 16 . Pour la production à grande échelle, un homogénéisateur à haute pression est utilisé pour perturber en continu les cellules 17. Cependant, cela pose souvent des problèmes dans la collecte de plasmides d'ADN fragmentés et d'ADN génomique plus contaminé en raison de ses forces dynamiques des fluides sévères pour la destruction 17 . Par conséquent, le développement d'une lyse continue très efficace et d'un protocole évolutif devient un problème difficile mais important.

Sur la base du protocole de lyse par ébullition classique 18, Lee et Lander ont apporté plusieurs modifications pour améliorer la méthode 19,20. Bien que ces modifications améliorent considérablement l'efficacité de la lyse par ébullition et le rendement en ADN plasmidique, elles nécessitent des étapes de centrifugation au stade de la collecte des bactéries et de l'extraction des plasmides, un équipement et des réactifs spéciaux. Dans un rapport récent 21, nous avons décrit une conception pour un protocole de flux à partir de bactéries cultivées pour l'extraction de l'ADN plasmidique. La conception schématique de l'appareil et de la configuration est illustrée à la figure 1. L'utilisation d'un module de membrane à fibres creuses de 0,2 m pour récolter les bactéries fermentées réduira au minimum l'étape de centrifugation, qui est l'une des étapes limitantes dans les grands- préparation à l'échelle. En pompant à travers les serpentins d'échange de chaleur, les cellules reçoivent un traitement thermique uniforme quel que soit le volume de l'échantillon, ce qui garantit la continuité et l'homogénéité de la lyse cellulaire. Le diamètre des bobines de cuivre peut varier en fonction du volume de fermentation. Cela offre une polyvalence pour tout volume d'échantillons donné. Ce protocole ne vise pas à augmenter le rendement de plasmide, mais à assurer la cohérence entre les lots, qui peuvent autrement manquer dans les méthodes de lyse bouillante. Une étape de centrifugation est cependant toujours nécessaire pour séparer le surnageant contenant le plasmide des bactéries lysées, ce qui nécessitera une optimisation supplémentaire. Dans l'ensemble, ce protocole fournit un système de préparation évolutif, efficace et rentable pour répondre aux besoins de la production de plasmides à grande échelle pour les laboratoires et l'industrie. Le protocole détaille principalement la lyse des cellules et l'extraction de l'ADN plasmidique, et bien que des procédures de purification supplémentaires puissent être nécessaires, elles ne sont pas expliquées en détail dans ce protocole.

Les cellules sont pompées du fermenteur dans le module à membrane à fibres creuses par une pompe péristaltique (P1) via une vanne d'entrée à 3 voies (V1) et lavées une fois avec du TE à l'intérieur du module. Le liquide résiduaire est évacué via une vanne de sortie (V2) dans un conteneur à déchets (C1). Après fermeture de la vanne de sortie V2, les cellules concentrées sont pompées de la sortie supérieure du module dans un conteneur de collecte de cellules (C2), où les cellules sont ajustées à la DO 600 nm de 100 par TE et traitées avec du lysozyme avant d'être pompées dans les bobines d'échange thermique par une deuxième pompe péristaltique (P2) les cellules passent d'abord à travers une bobine d'échange thermique (A) dans un bain-marie à 70 °C (C3) pour une lyse thermique continue, puis sont immédiatement pompées à travers une deuxième bobine d'échange thermique ( B) dans un bain de glace (C4) et sont recueillies dans un récipient, qui se trouve également dans le bain de glace. Après traitement thermique, les cellules lysées sont centrifugées et le surnageant est mélangé à 0,6 volume d'isopropanol et 1/10 de volume de NaOAc dans le récipient C5. Le plasmide précipité est collecté sur le filtre en nylon de 200 mesh (N), tandis que le liquide résiduaire est collecté dans le conteneur C6. Les précipités sont lavés avec 50 ml d'EtOH à 70 % et séchés à l'air.


Efficacité de l'isolement d'ADN plasmidique à partir de cultures de cellules E. coli congelées - Biologie

Améliorer l'efficacité de l'électrotransformation de l'ADN dans Escherichia coli Cellules électrocompétentes DH10B

Ning Wu
Centre de recherche et d'enseignement en biotechnologie
Université de Langston
Langston, OK 73050, États-Unis

Kanyand Matand*
Centre de recherche et d'enseignement en biotechnologie
Université de Langston
Langston, OK 73050, États-Unis
Courriel : [email protected]

Bizuayehu Kebede
Département de Chimie
École des arts et des sciences
Université de Langston
Langston, OK 73050, États-Unis

Georges Acquaah
Ministère de l'Agriculture et des Ressources naturelles
École d'agriculture et sciences appliquées
Université de Langston
Langston, OK 73050, États-Unis

Sonya Williams
Départements de biologie
Université de Langston
Langston, OK 73050, États-Unis

Aide financière: Cette étude a été partiellement financée par le programme USDA/CSREES et NSF/SURESTEP.

Mots clés: compétence cellulaire, ADN, E. coli DH10B, électroporation.

L'électrotransformation, également connue sous le nom d'électroporation, est l'outil le plus fiable et le plus efficace pour l'absorption d'ADN plasmidique. L'efficacité de l'électrotransformation est fonction de nombreux facteurs qui incluent (1) le nombre de lavages cellulaires avant l'électroporation, (2) le nombre de cellules d'électroporation, (3) la quantité d'ADN d'électroporation et (4) la phase de croissance cellulaire. Ces facteurs ont été étudiés de façon concomitante de façon limitée dans E. coli souche DH10B. Cette étude vise à explorer les facteurs clés ci-dessus pour définir les conditions optimales pour une efficacité d'électrotransformation élevée. Les résultats ont montré que l'efficacité de l'électrotransformation de E. coli DH10B a été augmenté à 1,5 x 109 cfu/µg en lavant les cellules trois fois avec 15 ml de glycerol à 10 %.Cela a éliminé les sels supplémentaires de la suspension cellulaire et amélioré l'électrotransformation en empêchant la formation d'arcs et en améliorant la résistance des cellules tout en garantissant un niveau de conductivité minimal. Phase exponentielle précoce à 0,15 OD600 était la meilleure phase de croissance pour améliorer l'électrotransformation de E. coli DH10B. Les résultats ont également montré qu'une efficacité d'électrotransformation plus élevée était obtenue de manière similaire lorsque 0,5 x 10 10 et 0,6 x 10 10 nombres de cellules étaient électroporés avec une quantité d'ADN allant de 10 à 40 pg. Cette étude a confirmé les conditions optimales pour la préparation de cellules électrocompétentes et l'électrotransformation d'ADN plasmidique, ce qui peut entraîner l'efficacité de transformation la plus élevée.

Article

L'électroporation est un processus physique restreint ionique qui nécessite une suspension cellulaire de haute résistance et de très faible conductivité pour un degré élevé de succès (Dower et al. 1988). Il est préféré à la méthode chimique pour transférer l'ADN exogène dans les bactéries, en raison de son (1) efficacité de transformation élevée qui convient à la transformation régulière des plasmides, de l'ADNc ligaturé et de l'ADN génomique (2) l'aptitude à utiliser moins d'ADN transformant pour une transformation élevée efficacité, qui est bénéfique pour l'ADN génique rare et/ou difficile à obtenir et (3) l'irréversibilité de la transformation par rapport à la méthode de transformation chimique (Kurien et Scofield, 1995). Cependant, cette méthode présente certaines limites. Par exemple, lors de la préparation de cellules électrocompétentes conventionnelles, le chlorure d'extra-sodium est normalement utilisé comme source d'ions majeure dans le milieu (environ 1% dans le milieu LB). Cette pratique peut réduire considérablement l'efficacité de l'électrotransformation et provoquer des arcs électriques. Par conséquent, tous les sels de la suspension cellulaire doivent être éliminés par un lavage poussé. Bien qu'un tampon à faible teneur en sels soit généralement utilisé pour éliminer ces sels, l'utilisation d'un tampon non ionique tel que le glycérol serait plus préférable. Des tampons tels que l'eau (Enderle et Farwell, 1998 Papagianni et al. 2007), l'eau et le glycérol (Sheng et al. 1995 Sharma et Schimke, 1996), ou les sels tampons et le glycérol ont également été largement utilisés (Dower et al. 1988) . Cependant, le glycérol est rarement utilisé seul comme tampon (Dorella et al. 2006). Il existe un besoin de méthodes alternatives de dessalement cellulaire car les protocoles actuels d'élimination du sel produisent des résultats variables qui sont difficiles à reproduire. De plus, des étapes de lavage et de remise en suspension étendues peuvent entraîner une contamination et une efficacité d'électroporation inférieure en raison d'une viabilité cellulaire plus faible (Sharma et Schimke, 1996).

Généralement, la préparation de cellules électrocompétentes conventionnelles est un processus relativement long qui implique plusieurs cycles de lavages et de centrifugation approfondis. Plus important encore, le protocole se traduit par une efficacité de transformation significativement faible, par rapport à ce qui est réalisé par les sociétés commerciales (Enderle et Farwell, 1998 Tu et al. 2005). Ainsi, les cellules compétentes préparées commercialement, même si elles sont très chères, sont devenues la source préférée d'un tel matériel dans les laboratoires de recherche et d'enseignement conventionnels. De plus, des protocoles standardisés sur différents E. coli souches ont été signalées (Chung et al. 1989 Tu et al. 2005). En dépit du fait que E. coli La souche DH10B est couramment utilisée en recherche (Narayanan et al. 1999 Poirel et al. 2005), seules des études limitées sur l'efficacité de transformation impliquant cet organisme ont été rapportées (Ceremonie et al. 2004). En outre, seuls des rapports très limités, voire aucun, ne se sont concentrés sur l'amélioration de l'efficacité de l'électro-transformation en faisant varier simultanément le nombre et la fréquence des cellules d'électroporation, la quantité d'ADN, le dessalement des cellules et la phase de croissance cellulaire, comme indiqué dans cette étude. Ces informations sont essentielles car l'efficacité de l'électrotransformation dépend de l'espèce et de la souche (Chung et al. 1989 Sheng et al. 1995 Enderle et Farwell, 1998 Tu et al. 2005). Par conséquent, il est essentiel de standardiser le protocole individuel pour l'amélioration de l'efficacité de la transformation sur cette souche.

Dans cette étude, nous rapportons les résultats d'une enquête qui s'est concentrée sur tous ces paramètres pour la normalisation du protocole d'électrotransformation pour E. coli souche DH10B, qui a entraîné une efficacité constamment améliorée. La caractéristique unique de cette enquête est qu'une efficacité d'électrotransformation plus élevée a été obtenue uniquement en ajustant les variables connexes au sein du protocole conventionnel existant, sans tenir compte de nouveaux paramètres. Les modifications apportées sont simples, efficaces, économiques et surtout reproductibles de manière cohérente dans les laboratoires de recherche et d'enseignement conventionnels.

Préparation des cellules électrocompétentes

Escherichia coli souche DH10B (génotype : F- mcrUn ∆(monsieur-hsdRMS-mcrJ.-C.) 𗾄lacZ∆M15 ∆lacX74 recA1 finirA1 ara � ∆(ara, leu)7697 filleU filleK λ- rpsL (Str R ) nupG) les cellules électrocompétentes (ELECTROMAX DH10B CELL, Cat. No. 18290-015) et l'ADN plasmidique pUC19 ont été achetés auprès d'INVITROGEN (Carlsbad, CA, USA). La bactérie a d'abord été striée sur une plaque de gélose LB et une seule colonie a été prélevée et cultivée dans 10 ml de milieu LB à 37°C, en agitant pendant une nuit. Une culture bactérienne de deux millilitres et demi a été transférée dans 500 ml de milieu LB et incubée à 37°C avec une agitation vigoureuse à 300 tr/min jusqu'à ce que la densité cellulaire atteigne l'absorbance désignée à 600 nm (A600). Ensuite, les cellules ont été recueillies par centrifugation et soumises à 15 ml de lavage au glycérol glacé à 10 %. Les cellules lavées ont été remises en suspension dans du glycérol glacé à 10 % et distribuées dans des aliquotes de 100 & microl avec le nombre approprié de cellules calculé selon la formule 1 OD600 = 5 x 10 8 cellules/ml fournies par le manuel d'instructions du spectrophotomètre SMARTSPEC 3000 (LABORATORIES BIO-RAD, Hercules, CA, USA). Les aliquotes cellulaires ont été soit directement appliquées pour l'électroporation de l'ADN plasmidique pUC19, soit rapidement congelées par de la glace sèche/éthanol et stockées à -80°C pour une utilisation future.

Analyses de variables d'électroporation

Une série d'essais d'électroporation a été réalisée en format triple en utilisant MicroPulser Electroporator (BIO-RAD LABORATORIES, Hercules, CA, USA) pour optimiser l'efficacité de l'électrotransformation de E. coli Cellules DH10B en optimisant différents paramètres d'électroporation, notamment le point de récolte de la croissance cellulaire, les temps de lavage des cellules, le nombre de cellules et la quantité d'ADN transformant. Les cellules ont été récoltées à trois DO différentes600 points de croissance comprenant 0,15, 0,25 et 0,45, qui représentaient les stades de phase exponentielle précoce, moyenne et tardive (log). Les cellules récoltées ont été dessalées par lavage une ou trois fois avec 15 ml de glycérol glacé à 10 % pour déterminer les temps de lavage optimaux requis pour éliminer les sels pour une efficacité de transformation maximale améliorée. Les cellules lavées ont été diluées et aliquotées à la concentration finale de 1, 0,9, 0,7, 0,6, 0,5 et 0,2 (x 10 10 ) cellules pour 100 µl de solutions, également pour déterminer le nombre optimal de cellules qui pourrait donner la meilleure efficacité d'électrotransformation. Enfin, ces échantillons de cellules ont été exposés à différentes quantités d'ADN transformant (dissous dans de l'eau pure) pour déterminer le nombre optimal de cellules qui absorbera le maximum d'ADN exogène lorsqu'elles seront exposées à des chocs électriques. Les quantités d'ADN transformant testées comprenaient 10, 20, 40 et 80 pg. Tous les échantillons ont été électroporés dans une cuvette à espacement de 0,2 cm (BIO-RAD, Hercules, CA) à 12,5 KV/cm (intensité de champ), 200 Ω (résistance) et 25 & microF (condensateur).

Amélioration de l'efficacité de la transformation via la phase de croissance cellulaire

Il y a trois étapes clés dans l'introduction d'ADN exogène dans E. coli: (1) la croissance des bactéries, (2) la préparation de la compétence cellulaire pour l'absorption d'ADN et (3) la transformation des cellules avec l'ADN. La phase exponentielle est la phase de croissance cellulaire la plus critique recommandée pour faciliter l'absorption maximale d'ADN exogène dans les bactéries. Il permet une croissance maximale et des divisions cellulaires à des taux constants, mais cela dépend de la souche, de la construction, de la composition chimique du milieu et des conditions d'incubation (Dower et al. 1988 Tu et al. 2005). Dans cette étude, E. coli Les cellules DH10B qui ont été utilisées et cultivées dans un milieu LB ont atteint une phase exponentielle dans les 2 heures suivant l'incubation, et trois cellules OD600 points de récolte, 0,15, 0,25 et 0,45 ont été déterminés en tant que représentants des stades de la phase exponentielle précoce, moyenne et tardive, respectivement (figure 1a). Les observations faites à ces trois points soutiennent l'hypothèse que la fréquence d'électrotransformation cellulaire est inversement proportionnelle à la taille de la population cellulaire (figure 1b). En conséquence, le stade de phase logarithmique précoce a donné une fréquence plus élevée de cellules qui ont été transformées que les stades de phase logarithmique moyen et tardif. De même, l'efficacité de la transformation était également inversement proportionnelle à la taille de la population cellulaire (figure 1c). La plus grande unité de formation de colonie de 1,5 x 10 9 par microgramme d'ADN transformant (cfu/µg) a été observée dans les cellules récoltées à la plus petite DO600, 0,15, comparé à 3,0 x 10 8 et 2,0 x 10 8 cfu/µg de cellules récoltées aux deux dernières DO600 points, 0,25 et 0,45, respectivement (Figure 1c). Cela renforce l'importance de la phase de croissance en général et des premiers stades de la phase logarithmique en particulier, dans les applications de routine en laboratoire. Cela appuie également le fait que l'ajustement de cette variable à lui seul peut maximiser E. coli efficacité de transformation cellulaire, à un niveau de production commerciale compétitif. La plage normale actuelle d'efficacité de transformation des cellules bactériennes industrielles est de 10 9 - 10 10 cfu/µg. Il a également été rapporté que les phases tardives de croissance cellulaire peuvent produire des efficacités de transformation aussi élevées que 10 5 à 10 7 transformants par microgramme d'ADN (Chung et al. 1989 Ceremonie et al. 2004). Ceci, associé au fait que, généralement, le stade de phase logarithmique précoce est caractérisé par une densité cellulaire plus faible par rapport aux stades de phase logarithmique tardifs, nous amène à recommander un OD600 plage de 0,20 à 0,25, pour assurer un nombre global plus élevé de transformants.

Amélioration de l'efficacité de la transformation grâce au dessalement cellulaire au glycérol

Lors de la préparation des cellules compétentes pour l'électroporation, il est essentiel de laver abondamment les cellules pour éliminer le milieu de culture résiduel et réduire la force ionique de la suspension cellulaire tout en garantissant sa haute résistance et sa très faible conductivité (Dower et al. 1988). Il est nécessaire d'éviter les interférences de sels qui pourraient réduire l'efficacité de l'électrotransformation et provoquer des arcs électriques. Au cours de cette étude, nous avons évalué l'efficacité d'un et trois lavages au glycérol glacé à 15 ml-10% des cellules récoltées pour réduire la force ionique de la suspension cellulaire et éliminer le milieu de culture résiduel avant l'aliquotage. L'enquête a donné des résultats qui ont montré un lien significatif et direct entre l'augmentation du nombre de lavages et l'efficacité de la transformation cellulaire. Nous avons observé qu'avec trois lavages, l'efficacité de la transformation cellulaire était augmentée de 7,5 à 60 fois par rapport aux cellules qui n'avaient été lavées qu'une seule fois (figure 2). L'amélioration de l'efficacité de la transformation cellulaire était constante, quelle que soit la quantité d'ADN transformant utilisée. Cependant, dans les conditions de cette étude, toute augmentation du nombre de lavages sur trois fois n'a pas montré d'augmentation notable de l'efficacité d'électrotransformation (données non présentées). Cela suggère que trois lavages étaient suffisants pour réduire les sels à la force ionique de niveau inférieur acceptable de la suspension pour une faible conductivité (Dower et al. 1988), ce qui garantit une résistance élevée requise pour le milieu d'électroporation (Sharma et Schimke, 1996). Les résultats renforcent la connaissance commune que l'élimination des sels avant le transfert d'ADN est une étape essentielle dans la préparation des cellules électrocompétentes.

Améliorer l'efficacité de la transformation grâce au nombre de cellules d'électroporation

Le nombre de cellules dans un échantillon d'électroporation est un autre paramètre essentiel qui peut être manipulé pour améliorer l'efficacité de la transformation cellulaire. Nous avons étudié l'impact d'une large gamme de nombre de cellules, 0,2-1 (x 10 10), sur l'efficacité de la transformation cellulaire. Les résultats ont montré un lien direct entre le nombre de cellules d'électroporation et l'efficacité de transformation. Le pic d'efficacité de transformation le plus élevé (3 x 10 8 cfu/µg) a été observé lorsque 0,5 x 10 10 et 0,6 x 10 10 nombres de cellules ont été électroporés, respectivement. Cependant, l'efficacité de la transformation a diminué lorsque l'électroporation impliquait le nombre de cellules au-delà de 0,6 x 10 10 (figure 3). Bien qu'il n'y ait pas d'explication claire pour ce résultat, nous pensons qu'une interaction limitée entre les molécules d'ADN et les cellules bactériennes pourrait être responsable. Ceci, parce que le nombre fixe de molécules transformantes dans une quantité d'ADN d'échantillon invariable pourrait de plus en plus interagir de manière limitée avec les cellules bactériennes d'électroporation maximale à mesure que leur nombre augmente. Une efficacité de transformation beaucoup plus faible (8,5 x 10 7 cfu/µg) a également été rapportée dans E. coli DH10B (Cérémonie et al. 2004). L'influence du nombre de cellules sur l'efficacité de la transformation cellulaire a déjà été étudiée sur une autre souche de E. coli (Chung et al. 1989). Dans cette étude, Chung et al. (1989) ont étudié trois niveaux de nombre de cellules (augmentation du nombre de cellules d'origine 1x, 10x et 100x). Les résultats ont montré que l'augmentation de 10x du nombre de cellules a donné le plus grand nombre de transformants (10,08 x 107 cfu/µg). L'augmentation du nombre de cellules au-delà de ce point a entraîné une diminution spectaculaire de l'efficacité de la transformation cellulaire. Lorsque des études similaires ont été menées sur d'autres espèces telles que Rhizobium leguminosarum (Garg et al. 1999), une augmentation continue de la transformation cellulaire a été observée en réponse à une augmentation continue du nombre de cellules d'électroporation.

Utilisation de la quantité d'ADN pour améliorer l'efficacité de la transformation cellulaire

L'efficacité de transformation est le nombre de cellules transformées à partir d'un microgramme d'ADN. Il a été étudié chez d'autres espèces bactériennes telles que Corynebacterium pseudotuberculosis (Dorella et al. 2006). Les résultats ont montré qu'il existait une relation inversement proportionnelle entre la quantité d'ADN plasmidique transformant et l'efficacité de la transformation (Dorella et al. 2006). Différentes quantités d'ADN pUC19 (10-80 pg) ont été utilisées pour transformer 0,5 x 1010 cellules électrocompétentes. Les résultats ont montré qu'il n'y avait pas de différence dans l'efficacité de transformation pour une quantité d'ADN allant de 10 à 40 pg, ce qui a provoqué l'efficacité de transformation la plus élevée de 3 x 108 cfu/µg (figure 2). Cependant, lorsque la quantité d'ADN transformant a été augmentée au-delà de 40 pg, l'efficacité de transformation a diminué de manière significative, de six fois. Dans ces conditions expérimentales, l'utilisation d'ADN plasmidique aussi peu que 10 pg assurera une efficacité de transformation maximale, ce qui pourrait maximiser l'utilisation efficace d'une quantité limitée de clones rares ou difficiles à obtenir de l'ADN génique et réduire le coût. Différentes espèces ou souches bactériennes réagissent différemment lorsqu'elles sont soumises à des quantités variables d'ADN transformant pour l'électroporation. Au sein d'autres E. coli souches, Chung et al. (1989) ont montré une augmentation numérique de l'efficacité de transformation lorsqu'il a été soumis à des quantités d'ADN de transformation allant de 10 pg à 1 ng. Cependant, les augmentations de la quantité d'ADN n'étaient pas statistiquement significatives. Leur étude a montré que lorsque la quantité d'ADN transformant était augmentée au-delà de 1 ng, l'efficacité de la transformation diminuait. Plus important encore, leur étude a montré une augmentation de l'efficacité de transformation numérique, de 6,20 x 10 7 à 7,33 x 10 7 cfu/µg, lorsque la quantité d'ADN de transformation a été augmentée dans E. coli DH10B, de 10 pg à 100 pg. Considérant une gamme similaire de quantité d'ADN transformant, nous avons observé une diminution spectaculaire de l'efficacité de transformation lorsque 80 pg et des quantités supérieures ont été testés. L'efficacité de transformation maximale dans cette étude résultant de la variable de quantité d'ADN testée, 3 x 10 8 cfu/µg, était également beaucoup plus élevée que leur valeur observée de 7,33 x 10 7 cfu/µg. Une autre souche de E. coli, NEB 5-alpha, qui a été étudié a montré une augmentation de l'efficacité de transformation au maximum de

2,6 x 10 10 transformants par microgramme d'ADN, lorsqu'il a été exposé à 100 pg d'ADN transformant.

Enfin, cette étude appuie les conclusions précédentes selon lesquelles le nombre de cellules, le dessalement cellulaire, la quantité d'ADN et la phase de croissance cellulaire sont des variables essentielles qui peuvent être manipulées efficacement de manière indépendante pour améliorer l'efficacité de l'électrotransformation cellulaire dans E. coli, souche DH10B. Phase de log précoce, à environ 0,15 OD600, est la meilleure étape de la phase de croissance cible pour échantillonner le potentiel des cellules de produire l'efficacité d'électrotransformation la plus élevée (1,5 x 10 9 cfu/µg). De plus, 15 ml de glycérol à 10 % peuvent être utilisés pour éliminer les sels supplémentaires de la suspension cellulaire et améliorer l'électrotransformation en empêchant la formation d'arcs et en améliorant la résistance des cellules tout en garantissant un niveau de conductivité minimal. L'optimisation de cette variable seule peut générer au moins 3 x 10 8 cfu/µg. Une efficacité d'électrotransformation similaire plus élevée (3 x 108 cfu/µg) peut également être obtenue lorsque les cellules d'électroporation sont exposées à une quantité d'ADN transformant allant de 10 à 40 pg. L'enquête renforce l'idée que même les laboratoires de biologie moléculaire de taille limitée et/ou à petit budget ont des opportunités égales pour la préparation de routine de cellules électrocompétentes avec une efficacité de transformation très élevée allant de 10 8 à 10 9 cfu/µg en manipulant le niveau de glycérol seul. Cette plage peut être étendue à 10 10 lorsque ces variables optimisées sont appliquées ensemble.

Les auteurs remercient Wondwessen Kebede, étudiant de premier cycle au Département de biologie, pour sa contribution au cours de la réalisation de cette étude.

CÉRÉMONIE, Hélène BURET, François SIMONET, Pascal et VOGEL, Timothy M. Isolement des bactéries du sol compétentes en matière de foudre. Microbiologie appliquée et environnementale, Octobre 2004, vol. 70, non. 10, p. 6342-6346. [CrossRef] [ Liens ]

CHUNG, C.T. NIEMELA, S.L. et MILLER, R.H. Préparation en une étape des compétences Escherichia coli: transformation et stockage de cellules bactériennes dans la même solution. Actes de l'Académie nationale des sciences des États-Unis d'Amérique, avril 1989, vol. 86, non. 7, p. 2172-2175. [CrossRef] [ Liens ]

DORELLA, F.A. ESTEVAM, E.M. CARDOSO, P.G. SAVASSI, B.M. OLIVEIRA, S.C. AZEVEDO, V. et MIYOSHI, A. Un protocole amélioré pour l'électrotransformation de Corynebacterium pseudotuberculosis. Microbiologie vétérinaire, mai 2006, vol. 114, non. 3-4, p. 298-303. [CrossRef] [ Liens ]

DOWER, William J. MILLER, Jeff F. et RAGSDALE, Charles W. Transformation à haute efficacité de E. coli par électroporation haute tension. Recherche sur les acides nucléiques, 1988, vol. 16, non. 13, p. 6127-6145. [CrossRef] [ Liens ]

ENDERLE, Patrick J. et FARWELL, Mary A. Electroporation de produits fraîchement plaqués Escherichia coli et Pseudomonas aeruginosa cellules. Biotechnique, décembre 1998, vol. 25, non. 6, p.954-958. [ Liens ]

GARG, Bindu DOGRA, Romesh C. et SHARMA, Parveen K. Transport à haute efficacité de Rhizobium leguminosarum par électroporation. Microbiologie appliquée et environnementale, juin 1999, vol. 65, non. 6, p. 2802-2804. [ Liens ]

KURIEN, Biji T. et SCOFIELD, R. Hal. Transformation de colonies bactériennes médiée par le polyéthylène glycol. Biotechnique, juin 1995, vol. 18, non. 6, p. 1023-1026. [ Liens ]

NARAYANAN, K. WILLIAMSON, R. ZHANG, Y. STEWART, A.F. et IOANNOU, P.A. Ingénierie efficace et précise d'un chromosome artificiel humain/bactérien de bêta-globine de 200 kb dans E. coli DH10B utilisant un système de recombinaison homologue inductible. Thérapie génique, mars 1999, vol. 6, non. 3, p. 442-447. [ Liens ]

PAPAGIANNI, Maria AVRAMIDIS, Nicholaos et FILIOUSSIS, George. Électrotransformation à haut rendement de Lactococcus lactis spp. lactis cellules prétraitées avec de l'acétate de lithium et du dithiothréitol. BMC Biotechnologie, mars 2007, vol. 7, non. 15. [CrossRef] [ Liens ]

POIREL, L. HERITIER, C. et NORDMANN, P. Caractérisation génétique et biochimique des lactamases de classe B codées par le chromosome de Shewanella livingstonensis (SLB-1) et Shewanella frigidimarina (SFB-1). Journal Chimiothérapie antimicrobienne, mai 2005, vol. 55, non. 5, p. 680-685. [CrossRef] [ Liens ]

SHARMA, Rakesh C. et SCHIMKE, Robert T. Préparation des électrocompétents E. coli en utilisant un milieu de croissance sans sel. Biotechnique, janvier 1996, vol. 20, non. 1, p. 42-44. [ Liens ]

SHENG, Yuling MANCINO, Valeria et BIRREN, Bruce. Transformation de Escherichia coli avec de grosses molécules d'ADN par électroporation. Recherche sur les acides nucléiques, juin 1995, vol. 23, non. 11, p. 1990-1996. [CrossRef] [ Liens ]

TU, Zhiming HE, Guangyuan LI, Kexiu X. CHEN, Mingjie J. CHANG, Junli CHEN, Lin YAO, Qing LIU, Dongping YE, Huan SHI, Jiantao et WU, Xuqian. Un système amélioré pour la préparation de cellules compétentes et la transformation de plasmides à haute efficacité utilisant différents Escherichia coli souches. Journal électronique de biotechnologie, avril 2005, vol. 8, non. 1. [CrossRef] [ Liens ]

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Friehs K : nombre de copies plasmidiques et stabilité plasmidique. Adv Biochem Eng Biotechnol. 2004, 86 : 47-82.

Jana S, Karan G, Deb JK : Purification de la streptomycine adénylyltransférase à partir d'un Escherichia coli recombinant. Expression et purification des protéines. 2005, 40 : 86-90. 10.1016/j.pep.2004.10.005.

Cserjan-Puschmann M, Grabherr R, Striedner G, Clementschitsch F, Bayer K : Optimisation des processus de fermentation microbienne recombinante – Une approche intégrée. Biopharm - Les technologies appliquées du développement biopharmaceutique. 2002, 15 : 26-34.

Schendel FJ, Baude EJ, Flickinger MC : Détermination de l'expression des protéines et du nombre de copies de plasmides à partir de gènes clonés dans Escherichia-Coli par analyse par injection de flux à l'aide d'un vecteur indicateur enzymatique. Biotechnologie et bio-ingénierie. 1989, 34 : 1023-1036. 10.1002/bit.260340802.

Weisblum B, Graham MY, Gryczan T, Dubnau D : Contrôle du nombre de copies de plasmide : isolement et caractérisation de mutants à nombre de copies élevé du plasmide pE194. J Bactériol. 1979, 137 : 635-643.

Olsson T, Ekwall K, Ruusala T: Le locus de type d'accouplement silencieux P dans la levure à fission contient deux séquences à réplication autonome. Acides nucléiques Res. 1993, 21 : 855-861. 10.1093/nar/21.22.5286-a.

Coppella SJ, Acheson CM, Dhurjati P: Isolement d'acides nucléiques de haut poids moléculaire pour l'analyse du nombre de copies à l'aide de la chromatographie liquide haute performance. J Chromatogr. 1987, 402 : 189-199. 10.1016/0021-9673(87)80017-1.

Schmidt T, Friehs K, Flaschel E : Détermination rapide du nombre de copies de plasmide. J Biotechnol. 1996, 49 : 219-229. 10.1016/0168-1656(96)01519-2.

Projan SJ, Carleton S, Novick RP : Détermination du nombre de copies de plasmide par densitométrie par fluorescence. Plasmide. 1983, 9 : 182-190. 10.1016/0147-619X(83)90019-7.

Lee CL, Ow DS, Oh SK : Réaction en chaîne par polymérase quantitative en temps réel pour la détermination du nombre de copies de plasmides dans les bactéries. J Méthodes Microbiol. 2006, 65 : 258-267. 10.1016/j.mimet.2005.07.019.

Bustin SA : quantification absolue de l'ARNm à l'aide d'essais de réaction en chaîne par polymérase par transcription inverse en temps réel. J Mol Endocrinol. 2000, 25 : 169-193. 10.1677/jme.0.0250169.

Bustin SA : Quantification d'ARNm par PCR en temps réel par transcription inverse (RT-PCR) : tendances et problèmes. Journal d'endocrinologie moléculaire. 2002, 29 : 23-39. 10.1677/jme.0.0290023.

Huggett J, Dheda K, Bustin S, Zumla A : stratégies et considérations de normalisation RT-PCR en temps réel. Gènes Immun. 2005, 6 : 279-284. 10.1038/sj.gene.6364190.

Espy MJ, Uhl JR, Sloan LM, Buckwalter SP, Jones MF, Vetter EA, Yao JD, Wengenack NL, Rosenblatt JE, Cockerill FR, Smith TF : PCR en temps réel en microbiologie clinique : applications pour les tests de routine en laboratoire. Clin Microbiol Rev. 2006, 19 : 165-256. 10.1128/CMR.19.1.165-256.2006.

Glynn B, Lahiff S, Wernecke M, Barry T, Smith TJ, Maher M : technologies de diagnostic moléculaire actuelles et émergentes applicables à la sécurité alimentaire bactérienne. Journal international de la technologie laitière. 2006, 59 : 126-139. 10.1111/j.1471-0307.2006.00253.x.

Watzinger F, Ebner K, Lion T : Détection et surveillance des infections virales par PCR en temps réel. Mol Aspects Med. 2006, 27 : 254-298. 10.1016/j.mam.2005.12.001.

Holst-Jensen A, Ronning SB, Lovseth A, Berdal KG : technologie PCR pour le criblage et la quantification des organismes génétiquement modifiés (OGM). Anal Bioanal Chem. 2003, 375 : 985-993.

Miraglia M, Berdal KG, Brera C, Corbisier P, Holst-Jensen A, Kok EJ, Marvin HJ, Schimmel H, Rentsch J, van Rie JP, Zagon J : Détection et traçabilité des organismes génétiquement modifiés dans la chaîne de production alimentaire. Food Chem Toxicol. 2004, 42 : 1157-1180. 10.1016/j.fct.2004.02.018.

Bubner B, Baldwin IT : Utilisation de la PCR en temps réel pour déterminer le nombre de copies et la zygosité dans les plantes transgéniques. Plant Cell Rep. 2004, 23 : 263-271. 10.1007/s00299-004-0859-y.

Ingham DJ, Beer S, Money S, Hansen G : dosage PCR quantitatif en temps réel pour déterminer le nombre de copies de transgènes dans les plantes transformées. Biotechniques. 2001, 31 : 132-140.

Mason G, Provero P, Vaira AM, Accotto GP : Estimation du nombre d'intégrations dans des plantes transformées par PCR quantitative en temps réel. BMC Biotechnol. 2002, 2 : 20-20. 10.1186/1472-6750-2-20.

Ballester M, Castello A, Ibanez E, Sanchez A, Folch JM : système quantitatif en temps réel basé sur la PCR pour déterminer le nombre de copies de transgènes chez les animaux transgéniques. Biotechniques. 2004, 37 : 610-613.

Mitrecic D, Huzak M, Curlin M, Gajovic S : Une méthode améliorée pour la détermination du nombre de copies de gènes chez des souris transgéniques par des courbes de dilution en série obtenues par un test PCR quantitatif en temps réel. Méthodes J Biochem Biophys. 2005, 64 : 83-98. 10.1016/j.jbbm.2005.05.006.

Lee C, Kim J, Shin SG, Hwang S : quantification QPCR absolue et relative du nombre de copies de plasmides dans Escherichia coli. J Biotechnol. 2006, 123 : 273-280. 10.1016/j.jbiotec.2005.11.014.

Providenti MA, O'Brien JM, Ewing RJ, Paterson ES, Smith ML : Le nombre de copies de plasmides et d'autres éléments génétiques peut être déterminé par PCR quantitative en temps réel basée sur SYBR-Green. J Méthodes Microbiol. 2006, 65 : 476-487. 10.1016/j.mimet.2005.09.007.

Tao L, Jackson RE, Cheng Q : évolution dirigée du nombre de copies d'un plasmide à large gamme d'hôtes pour l'ingénierie métabolique. Génie métabolique. 2005, 7 : 10-17. 10.1016/j.ymben.2004.05.006.

Carapuca E, Azzoni AR, Prazeres DMF, Monteiro GA, Mergulhao FJM : détermination dans le temps du contenu en plasmides dans les cellules eucaryotes et procaryotes à l'aide de la PCR en temps réel. Biotechnologie Moléculaire. 2007, 37 : 120-126. 10.1007/s12033-007-0007-3.

Crosa JH, Tolmasky ME, Actis LA, Falkow S : Plasmides. Méthodes de bactériologie générale et moléculaire. Edité par : Gerhardt P, Murray RGE, Wood WA, Krieg NR. 1994, Washington. : Société américaine de microbiologie, 465-386.

Rocha EPC : L'organisation liée à la réplication des génomes bactériens. Microbiologie. 2004, 150 : 1609-1627. 10.1099/mic.0.26974-0.

Teich A, Lin HY, Andersson L, Meyer S, Neubauer P : Amplification de plasmides apparentés à ColE1 dans des cultures recombinantes d'Escherichia coli après induction par IPTG. Journal de biotechnologie. 1998, 64 : 197-210. 10.1016/S0168-1656(98)00108-4.

Grabherr R, Bayer K : Impact de la conception de vecteurs ciblés sur la réplication du plasmide ColE1. Tendances en biotechnologie. 2002, 20 : 257-260. 10.1016/S0167-7799(02)01950-9.

Bischoff C, Luthy J, Altwegg M, Baggi F : Détection rapide d'E. coli diarrhéique par PCR en temps réel. J Méthodes Microbiol. 2005, 61 : 335-341. 10.1016/j.mimet.2004.12.007.

Chapman PA, Ellin M, Ashton R, Shafique W : Comparaison de la culture, de la PCR et des tests immunologiques pour la détection d'Escherichia coli O157 après une culture d'enrichissement et une séparation immunomagnétique réalisée sur des produits de viande crue naturellement contaminés. Int J Microbiol Alimentaire. 2001, 68 : 11-20. 10.1016/S0168-1605(01)00464-0.

Morsczeck C, Langendorfer D, Schierholz JM : Un test PCR quantitatif en temps réel pour la détection de tetR de Tn10 dans Escherichia coli en utilisant SYBR Green et l'Opticon. Méthodes J Biochem Biophys. 2004, 59 : 217-227. 10.1016/j.jbbm.2004.02.003.

Abolmaaty A, El Shemy MG, Khallaf MF, Levin RE : Effet des méthodes de lyse et de leurs variables sur le rendement d'Escherichia coli O157 : ADN H7 et son amplification PCR. Journal des méthodes microbiologiques. 1998, 34 : 133-141. 10.1016/S0167-7012(98)00084-0.

Pfaffl MW : Un nouveau modèle mathématique pour la quantification relative en RT-PCR en temps réel. Recherche sur les acides nucléiques. 2001, 29 (9) : e45-10.1093/nar/29.9.e45.


Isolement de l'ADN génomique

Le rendement, la pureté et l'intégrité sont essentiels à la performance dans les applications en aval telles que la PCR et le séquençage. L'optimisation des méthodologies d'extraction est la clé du succès avec des types d'échantillons difficiles et des applications en aval exigeantes. L'ADN cible purifié doit être exempt de contaminants, notamment de protéines, d'autres composants cellulaires et d'acides nucléiques indésirables.

Des kits de purification spécialisés et spécifiques à un type d'échantillon peuvent être nécessaires pour des échantillons plus complexes et difficiles qui contiennent de l'ADN dégradé ou ont de faibles concentrations d'ADN. Les types d'échantillons difficiles comprennent les tissus FFPE, le plasma ou le sérum contenant de l'ADN acellulaire, les échantillons médico-légaux ou toute source où la quantité d'échantillons est limitée.

Promega a été l'une des premières sociétés à fournir des kits pour la purification de l'ADN, ainsi que des plasmides, avec plus de 30 ans d'expérience dans l'extraction d'acides nucléiques. Nous proposons une large gamme de kits d'extraction d'ADN génomique adaptés à une variété de types d'échantillons et de besoins de débit, produisant des rendements élevés et un ADN de haute qualité à utiliser dans vos applications en aval. Nos produits couvrent une variété d'options de débit et de méthodes de traitement adaptées à vos besoins spécifiques, des préparations simples manuelles aux petits systèmes de paillasse ou aux systèmes automatisés à grande échelle.

Utilisant des méthodes de rotation, de vide ou magnétiques, nos solutions manuelles à préparation unique sont idéales pour traiter moins de 24 échantillons à la fois. Si vous recherchez une solution automatisée, nos kits à base de cartouches à utiliser avec les instruments Maxwell® peuvent traiter jusqu'à 48 échantillons dans le même cycle. Nous proposons également des options d'extraction à haut débit entièrement automatisées utilisant des méthodes de traitement à base de plaques, entièrement compatibles avec les plates-formes de manipulation de liquides.

Bien que des techniques telles que le transfert de Southern, qui nécessitent des quantités d'ADN de l'ordre du microgramme, soient toujours effectuées dans des laboratoires de biologie moléculaire, la plupart des évaluations de l'ADN chromosomique sont effectuées par des technologies basées sur la PCR. Ceux-ci incluent la PCR monoplex ou multiplex, les matrices SNP, l'analyse et la PCR en temps réel, la ddPCR et le séquençage de nouvelle génération (NGS). Ces dernières techniques utilisent des quantités de nanogrammes d'ADN par réaction. Quel que soit le système choisi, les kits de purification d'ADN génomique Promega fournissent les rendements requis d'ADN de haute qualité avec un minimum de contaminants.

Systèmes de purification manuelle

Systèmes basés sur des solutions

Promega propose des systèmes d'isolement d'ADN génomique basés sur la lyse des échantillons par des détergents et la purification par diverses méthodes. Ceux-ci incluent à la fois des systèmes à membrane (par exemple, le système de purification d'ADN génomique Wizard® SV à colonne unique (Cat.# A2360, A2361) ou le système de purification d'ADN génomique à 96 puits Wizard® SV 96 (Cat.# A2370, A2371) et des systèmes de silice paramagnétique facilement automatisés.Tous ces systèmes purifient l'ADN génomique qui peut être utilisé dans de nombreuses applications en aval.

Le kit de purification d'ADN génomique Wizard® (Cat. # A1120, A1125, A1620) est à la fois un système polyvalent et évolutif pour isoler l'ADN génomique à l'aide d'une méthode basée sur la précipitation. Avec ce seul système, l'ADN chromosomique peut être isolé à partir de sang total (5), de feuilles de plantes (6), de bactéries Gram-positives (7) et Gram-négatives (8), de queue de souris (9) et de levure (10). Des types d'échantillons supplémentaires tels que des champignons (11), des tissus de grenouille infectés incrustés dans de la paraffine (12), de la salive (13) et des coléoptères de la farine (14) ont également été utilisés avec succès.

Ce système de purification génomique est non seulement efficace avec de nombreux types d'échantillons, mais il est également facilement adapté à la quantité de matériau de départ en ajustant les volumes de réactifs pour répondre à vos besoins.

Systèmes basés sur des colonnes

Systèmes traditionnels à colonnes

Pour l'isolement sur une seule colonne, le système de purification d'ADN génomique Wizard® SV fournit une technique simple et rapide pour la préparation d'ADN purifié et intact à partir de queues de souris, de tissus et de cellules cultivées en aussi peu que 20 minutes, selon le nombre d'échantillons traités (jusqu'à 24 par centrifugation, selon la taille du rotor, ou jusqu'à 20 par le vide). Un collecteur à vide ou une microcentrifugeuse est utilisé pour le traitement des échantillons. Avec quelques modifications, le sang total peut également être utilisé avec ce système d'isolement (15). Il s'agit d'un système à membrane de silice, ce qui signifie qu'il existe des limites à la quantité de matériau pouvant être chargé sur une seule colonne SV jusqu'à 20 mg de tissu (queue de souris ou tissu animal) ou entre 1 × 10 4 et 5 × 10 6 les cellules de culture tissulaire peuvent être traitées par purification. Avec plus d'échantillon, le lysat préparé peut devoir être divisé en deux colonnes ou plus pour éviter le colmatage.

Figure 2. Amplification d'ADN génomique isolé à partir de diverses sources tissulaires à l'aide du système de purification d'ADN génomique Wizard® SV. Un microlitre d'ADN génomique purifié a été amplifié en utilisant PCR Master Mix (Cat. # M7502) et des amorces IL-1&beta spécifiques à la souris (produit de 1,2 kb). Des réactions avec de l'ADN génomique de souris (Cat. # G3091 +C) et sans ADN (&ndashC) ont été réalisées en tant que témoins positifs et négatifs, respectivement. Les conditions du cycle thermique étaient : un cycle de 3 minutes à 95°C suivi de 30 cycles de : 95°C pendant 30 secondes, 60°C pendant 1 minute, 70°C pendant 1 minute et 30 secondes d'extension finale à 70°C pendant 7 minutes 4°C tremper. Toutes les pistes contenaient 10 microlitres de produit de réaction séparés sur un gel d'agarose à 1 %. Les produits de PCR ont été visualisés par coloration au bromure d'éthidium. Les désignations &ldquoSpin&rdquo et &ldquoVacuum&rdquo indiquent le protocole utilisé pour l'isolement de l'ADN génomique.

L'ADN génomique isolé avec le système de purification d'ADN génomique Wizard® SV est de haute qualité et fonctionne bien dans l'analyse sur gel d'agarose, les digestions par enzymes de restriction et l'analyse PCR, comme le montre la figure 2. Le tableau 1 fournit des rendements typiques d'ADN génomique purifié à partir d'une variété de sources.

Tableau 1. Rendement d'ADN génomique typique de divers tissus à l'aide du système de purification d'ADN génomique Wizard® SV.

Échantillon Montant Rendement moyen
Coupure de la queue 20mg 20µg
Le foie 20mg 15µg
Cœur 20mg 10µg
Cerveau 20mg 6µg
Cellules CHO 1 × 10 6 5µg
Cellules NIH/3T3 1 × 10 6 9µg
293 cellules 1 × 10 6 8µg

Les chercheurs ont utilisé ce système simple et rapide pour de nombreux types d'échantillons et applications supplémentaires, notamment les moustiques (16), les cellules souches mammaires (17), Bacillus subtilis (18), Escherichia coli (19), la forme larvaire du Schistosoma mansoni parasite (20) et ADN viral de cellules BC3 infectées par le virus de l'herpès sarcome de Kaposi (21).

Pour l'isolement à 96 puits à haut débit, le système de purification d'ADN génomique Wizard® SV 96 est disponible. L'ADN génomique amplifiable peut être isolé à partir de 5 à 10 6 cellules, 20 mg de tissu ou jusqu'à 1,2 cm d'extrémité de queue de souris sans centrifugation du lysat avant la purification.

Ce système multipuits nécessite un collecteur à vide (Vac-Man® 96 Vacuum Manifold, Cat.# A2291) et une pompe à vide capable de générer 15&ndash20 pouces de mercure ou l'équivalent. L'ADN génomique a été isolé à partir de trois types de sources différents, puis utilisé dans une PCR monoplex et exécuté sur un gel d'agarose, comme le montre la figure 3. La figure 4 compare le rendement des trois méthodes de purification d'ADN génomique Wizard® SV (plaque à 96 puits, vide et centrifugation ).

Figure 3. Électrophorèse sur gel d'agarose de produits PCR amplifiés à partir de 1 & microl de queue de souris, de cellules CHO et d'ADN génomique d'échantillons de feuilles de tomate isolés à l'aide du système de purification d'ADN génomique Wizard® SV 96. Un total de 10 microlitres de produit PCR est visualisé sur un gel d'agarose à 1,5% coloré au bromure d'éthidium. Panneau A. IL-1&beta (1,2 kb) amplifié à partir de la queue de souris. Panneau B. &bêta-actine (250 pb) amplifiée à partir de cellules CHO. Panneau C. ADN de chloroplaste (600 pb) amplifié à partir de feuilles de tomate. Piste M, échelle d'ADN de 1 kb (Cat. # G5711).

Figure 4. Comparaison des rendements d'ADN à l'aide des systèmes de purification d'ADN génomique Wizard® SV et SV 96. Rendement moyen d'ADN génomique en microgrammes purifié à partir de 20 mg de coupures de queue de souris. La moyenne A260/UNE280 les ratios sont : SV 96, 1,7 + 0,08 SV sous vide, 1,7 + 0,14 SV spin, 1,7 + 0,14.

Systèmes à colonnes hautes performances

Nous proposons deux systèmes ReliaPrep&trade gDNA Miniprep différents qui purifient l'ADN génomique à l'aide d'une méthode basée sur une colonne de cellulose : ReliaPrep&trade Blood gDNA Miniprep System (Cat.# A5081, A5082) et ReliaPrep&trade gDNA Tissue Miniprep System (Cat.# A2051, A2052). Les deux sont des systèmes prêts à l'emploi qui permettent d'obtenir un ADN génomique intact sans utiliser de lavages à l'éthanol ou de précipitations. Le système ReliaPrep&trade Blood gDNA Miniprep System traite 200 & mul de sang ou de fluide corporel, frais ou congelé, en moins de 40 minutes. Les rendements sanguins sont généralement de 4&ndash10&mug, selon le nombre de globules blancs. Jusqu'à 25 mg de tissu, un écouvillon buccal (joue) ou une queue de souris de 1 cm peuvent être traités avec le système ReliaPrep&trade gDNA Tissue Miniprep et l'ADN élué récupéré en 30 minutes ou moins. L'ADN purifié peut être élué en aussi peu que 50 microlitres et convient à une utilisation dans des applications en aval telles que la RT-qPCR.

Figure 5.Le rendement en ADN génomique du système ReliaPrep&trade Blood gDNA Miniprep varie en fonction du nombre de globules blancs. Du sang total a été prélevé sur plusieurs individus et le nombre de globules blancs a été déterminé à l'aide d'un hémocytomètre. Deux cents microlitres de sang ont été utilisés pour la purification de l'ADN génomique (n = 3 ou 4), et la quantité d'ADNg isolé a été quantifiée par spectroscopie d'absorbance.

Figure 6. Comparaison du volume d'élution avec la concentration, le rendement et la pureté. Des aliquotes de sang (200 & mul) ont été traitées à l'aide du système ReliaPrep & Trade Blood gDNA Miniprep (n = 4) et éluées avec 30 & ndash200 & mul d'eau sans nucléase. Concentration (Panneau A), rendement total (Panneau B) et la pureté (Panneau C) ont été évalués par spectroscopie d'absorbance. Le rendement diminuait légèrement avec la diminution du volume d'élution, tandis que la concentration augmentait. La pureté telle que mesurée par les rapports de densité optique est restée constante.

Systèmes automatisés pour la purification de l'ADN

Alors que les laboratoires tentent d'améliorer la productivité de la recherche, des diagnostics et des tests appliqués, le besoin d'une automatisation facile à utiliser et à débit faible à modéré des processus de purification s'est accru. L'automatisation élimine le temps et le travail de purification manuelle, vous donnant plus de temps et d'énergie pour vous concentrer sur vos recherches.

Systèmes à cartouche

Traditionnellement, l'automatisation fait référence à l'utilisation d'équipements volumineux, spécialisés et coûteux qui nécessitent une formation approfondie pour fonctionner et entretenir. Promega a développé les systèmes Maxwell®, qui offrent des alternatives flexibles, fiables, compactes et faciles à utiliser aux systèmes automatisés traditionnels.

Les systèmes Maxwell® sont conçus pour une purification efficace et automatisée à partir d'un large éventail de types d'échantillons (voir Tableau 2). Les instruments Maxwell® sont fournis avec des méthodes de purification automatisées préprogrammées et peuvent traiter jusqu'à 48 échantillons en aussi peu que 30 à 40 minutes (selon l'instrument, le type d'échantillon et la méthode). L'ADN ou l'ARN concentré purifié est de haute qualité et à haut rendement, ce qui les rend compatibles avec de nombreuses applications courantes en aval, notamment la qPCR, la ddPCR, le génotypage, le séquençage et la NGS.

Figure 7. Le Maxwell® RSC (à gauche) et le Maxwell® RSC 48 (à droite).

Tableau 2. Rendement d'ADN de divers types d'échantillons après purification à l'aide de l'instrument Maxwell® RSC et des kits de purification d'ADN.

Jusqu'à 50 mg de tissu hépatique
Jusqu'à 50 mg de tissu pulmonaire

Les kits Maxwell® proposent des cartouches de réactifs prédistribuées pour la purification de l'ADN génomique, de l'ARN et de l'acide nucléique total. Les kits axés sur l'application et le type d'échantillon font des instruments Maxwell® un instrument d'extraction polyvalent pour les laboratoires pouvant fonctionner avec une ou toutes ces différentes applications.

Figure 8. Les méthodes d'extraction d'ADN ou d'ARN Maxwell® RSC commencent par des cartouches préremplies de réactifs de purification et de particules paramagnétiques, prêtes pour vos échantillons. Après l'ajout de l'échantillon, le Maxwell® RSC déplace les particules paramagnétiques et les acides nucléiques associés à travers plusieurs étapes, produisant finalement un ARN ou un ADN très pur dans 30 à 100 µl.

Les systèmes Maxwell® purifient les échantillons à l'aide de particules paramagnétiques (PMP), qui fournissent une phase solide mobile qui optimise la capture des échantillons, le lavage et l'élution de l'acide nucléique. Les instruments Maxwell® sont des instruments de manipulation de particules magnétiques qui lient efficacement les acides nucléiques à la particule paramagnétique dans le premier puits d'une cartouche préremplie. Les échantillons sont traités par une série de lavages avant que l'acide nucléique ne soit élué. La méthodologie systématique basée sur les particules magnétiques utilisée par les instruments Maxwell® évite les problèmes courants associés aux systèmes de purification automatisés basés sur les manipulateurs de liquides, tels que les pointes obstruées ou les transferts partiels de réactifs, qui peuvent entraîner un traitement de purification sous-optimal.

Les instruments Maxwell® compacts de paillasse sont faciles à installer et ne nécessitent aucune formation particulière pour leur utilisation. Des méthodes automatisées optimisées sont préchargées, les cartouches de réactifs préremplies sont mises en place, votre échantillon est ajouté et vous sélectionnez « Démarrer » pour commencer la méthode appropriée. Une liste complète des kits d'extraction d'acide nucléique est disponible ici.

Plusieurs kits de réactifs Maxwell® Instrument sont disponibles et permettent une extraction optimale à partir de divers types d'échantillons, y compris le sang, le sérum et le plasma, les tissus fixés au formol et inclus en paraffine (FFPE), les bactéries, les tissus végétaux, alimentaires et animaux.

Les systèmes Maxwell® HT permettent la purification d'ADN ou d'ARN à grande échelle sur n'importe quel manipulateur de liquide de laboratoire au format SLAS à 24 ou 96 puits. Les chimies de purification Maxwell® utilisent de nouvelles solutions à base de particules magnétiques qui diminuent naturellement le transfert de contamination.

En plus d'une chimie de confiance, vous bénéficiez d'un support expert pour démarrer avec l'automatisation ou optimiser votre flux de travail HT actuel. Notre équipe d'experts en automatisation peut offrir une assistance avec la plupart des principaux fournisseurs d'automatisation de laboratoire dans le monde et vous aider à développer et à mettre en œuvre une solution automatisée de purification d'acide nucléique adaptée aux besoins de votre laboratoire.

Kits d'extraction d'ADN génomique

Vous recherchez des options d'extraction par échelle ou type d'échantillon ? Explorez notre portefeuille d'extraction d'ADN pour découvrir la solution adaptée à vos besoins de purification.

Solutions d'automatisation évolutives

Les instruments Maxwell® RSC fournissent une plate-forme de purification d'acide nucléique compacte et automatisée qui traite jusqu'à 16 (Maxwell ® RSC) ou jusqu'à 48 (Maxwell ® RSC 48) échantillons simultanément.

Chimie de purification à haut débit et assistance à l'automatisation

Les chimies Maxwell® HT permettent l'automatisation de la purification des acides nucléiques sur les manipulateurs de liquides. Notre équipe d'experts en automatisation offre une assistance pour vous aider à développer et à mettre en œuvre une solution automatisée de purification d'acides nucléiques adaptée aux besoins de votre laboratoire.

Systèmes à haut débit pour l'isolement de l'ADN génomique

Promega propose plusieurs options automatisées à haut débit pour isoler l'isolement d'ADN génomique à partir d'échantillons de sang. Certains laboratoires, tels que les biobanques, souhaitent isoler l'ADN de grandes quantités de matériel de départ (par exemple, 10 ml de sang). Le système d'isolement d'ADNg HT à grand volume ReliaPrep &trade (Cat. # A2751) fournit un moyen efficace d'isoler l'ADN génomique dérivé de fractions sanguines dérivées d'échantillons de 2,5 & ndash10 ml de sang total. Cette chimie peut être automatisée sur des manipulateurs de liquides à l'aide d'un appareil Promega HSM, qui permet le traitement des réactions de purification dans des tubes coniques de 50 ml.

Le logiciel de détection de niveau de liquide et d'exploitation de l'instrument adapte la chimie au volume d'entrée de l'échantillon pour chaque échantillon individuel, réduisant ainsi les déchets et les dépenses de réactifs. Le système automatisé peut également traiter des échantillons dans des tubes de 14 ml à l'aide de l'adaptateur à faible volume XAT1020 (LVA et méthodes) qui permet de traiter des échantillons de 0,25 à 3 ml.

Il n'y a pas d'étapes de centrifugation fastidieuses ni de produits chimiques dangereux, qui manipulent intrinsèquement un poste de travail, offrant une purification rapide de l'ADN génomique du sang total, quelles que soient les conditions de stockage ou d'expédition des échantillons.

Graphique 9. L'ADN a été isolé du sang total par trois méthodes, séparé par électrophorèse sur gel CHEF et visualisé par coloration au bromure d'éthidium. L'ADN isolé à l'aide du système d'isolement d'ADNg HT à grand volume de ReliaPrep&trade a fourni un ADN avec une plage de tailles de 20 à 125 kb.

Il existe une option pour l'isolement à faible débit de l'ADNg à partir d'un maximum de 32 échantillons à la fois lorsque l'instrument Heater Shaker Magnet (HSM 2.0 Cat. # A2715) est utilisé sur une paillasse plutôt qu'intégré sur un manipulateur de liquide où l'utilisateur distribue et aspire réactifs des échantillons comme indiqué par le logiciel sur un écran d'ordinateur. Les méthodes préprogrammées contrôlent le chauffage, l'agitation, la magnétisation et la synchronisation des étapes requises pour la purification semi-automatisée.

En plus du sang total, une variété d'autres types d'échantillons peuvent également être traités, y compris la salive stabilisée, les échantillons de lavage buccal, les fractions sanguines, les couches leucocytaires, les culots de globules rouges et tous les culots de cellules. Pour une purification entièrement automatisée, l'instrument HSM 2.0 peut être intégré à un poste de travail robotique de manipulation de liquides.

L'automatisation des réactifs sur l'instrumentation nécessite une approche soigneusement planifiée et exécutée. Collaborer avec Promega vous donne accès à des scientifiques qui ont conçu une purification automatisée pour des centaines de laboratoires, sur un large éventail de types d'échantillons.

L'automatisation des réactifs sur l'instrumentation nécessite une approche soigneusement planifiée et exécutée. Collaborer avec Promega vous donne accès à des scientifiques qui ont conçu une purification automatisée pour des centaines de laboratoires, sur un large éventail de types d'échantillons.

Figure 10. Rendements d'ADN automatisés pour les fractions sanguines. Le rendement en ADN est linéaire par rapport aux volumes originaux de sang. Panneau A. Rendements d'ADN déterminés par le spectrophotomètre NanoDrop. Panneau B. Rendements d'ADN déterminés à l'aide du système QuantiFluor&trade dsDNA. Tous les échantillons ont été préparés à partir d'un seul donneur. Les échantillons manuels ont été traités à l'aide du kit de purification d'ADN génomique Wizard®. Chaque point est la moyenne de n=4 valeurs avec des barres d'erreur de 1 écart type.

Purification d'acide nucléique HT personnalisée

La mise en œuvre de technologies automatisées de purification d'acides nucléiques sur votre flux de travail à haut débit peut être difficile et prendre du temps. Nos scientifiques de l'assistance sur le terrain peuvent vous fournir le soutien dont vous avez besoin pour démarrer.

Kits de purification d'ADN sélectionnés par type d'échantillon

Apprenez-en plus sur certains de nos kits spécialisés ci-dessous, explorez l'étendue de notre portefeuille et comparez nos kits d'extraction d'ADN à l'aide de notre page de comparaison de produits pour découvrir la bonne solution pour vos besoins de purification d'ADN.

Isolement de l'ADN génomique des tissus fixes

Le système MagneSil® Genomic, Fixed-Tissue System (Cat.# MD1490), fournit une technique simple et rapide pour la préparation d'ADN génomique à partir de tissus fixés au formol et inclus en paraffine. Après une nuit de digestion à la protéinase K, l'ADN génomique peut être purifié manuellement à partir de coupes de tissus minces FFPE en moins d'une heure. L'ADN génomique amplifiable peut être isolé à partir de sections de 10 µm sans centrifugation du lysat avant purification. Jusqu'à 12 échantillons peuvent être traités au format manuel à l'aide d'un support de séparation magnétique MagneSphere® Technology (Cat.# Z5332, Z5342).

Figure 11. Analyse d'ADN purifié à partir de coupes minces de 10 µm incluses en paraffine et fixées au formol à l'aide du système MagneSil® Genomic, Fixed Tissue System. L'ADN purifié a été amplifié et les produits d'amplification ont été analysés sur un analyseur génétique ABI PRISM® 310 ou 3100. Panneau A. Amplification avec un ensemble de 16 amorces marquées par fluorescence. Les produits d'amplification varient en taille de 104 à 420 bases. Panneau B. Un fragment de 972 bases amplifié à l'aide d'un jeu d'amorces d'amélogénine. Panneau C. Un fragment de 1,8 kb amplifié à partir du Adénomatose polypose coli (APC) gène. L'augmentation du temps d'extension pendant l'amplification peut aider à équilibrer les rendements entre les petits et les grands produits d'amplification et à augmenter les rendements pour les grands produits d'amplification. Les résultats varieront en fonction du degré de réticulation due à la fixation du formol.

L'un des avantages de ce système par rapport aux autres méthodes de purification, telles que l'extraction au phénol:chloroforme, est sa capacité à éliminer la plupart des inhibiteurs d'amplification, y compris de très petits fragments d'ADN. Un tissu qui a été stocké dans du formol pendant de longues périodes peut être trop réticulé ou trop dégradé pour bien fonctionner comme matrice pour l'amplification. La figure 11 montre une amplification de 16 loci de répétition en tandem courte (STR) et démontre à quel point l'ADN isolé peut fonctionner en PCR multiplex en utilisant le système PowerPlex® 16 HS (Cat.# DC2101, DC2100).

Le kit Maxwell® RSC FFPE Plus DNA (Cat.# AS1720) est une méthode automatisée pour purifier jusqu'à 48 échantillons d'une à dix sections de 5 μm d'échantillons de tissus FFPE sur l'instrument Maxwell® RSC (Cat.# AS4500 1–16 cartouches par analyse) ou l'instrument Maxwell® RSC 48 (réf. AS8500 1 à 48 échantillons par analyse). La chimie FFPE Plus est conçue pour fournir un rendement élevé d'ADN à partir de FFPE lorsqu'il est mesuré par spectroscopie qui convient aux applications d'amplification, y compris la qPCR, la PCR multiplex et la NGS. Le protocole offre une flexibilité avec un déparaffinage rapide d'une heure ou un protocole de nuit de 24 heures pour s'adapter à vos besoins de flux de travail.

La chimie Maxwell® RSC DNA FFPE est la dernière technologie FFPE de Promega et a été conçue pour fournir un ADN hautement amplifiable. Économisez du temps et de la main-d'œuvre en utilisant l'une ou l'autre des substances chimiques FFPE avec les instruments Maxwell® et évitez l'exposition au xylène dangereux utilisé dans d'autres produits de purification FFPE. Nos tests de qualité ont également démontré qu'il n'y avait pratiquement pas d'inhibiteurs de PCR dans les échantillons d'ADN purifiés, ce qui rend votre PCR et d'autres applications en aval un jeu d'enfant.

Utilisant la même chimie que l'ADN Maxwell® RSC FFPE, le système d'isolement Maxwell® HT DNA FFPE (Cat. # A6372) fournit une méthode simple et fiable pour l'isolement rapide et à haut débit de l'ADN génomique à partir d'échantillons de tissus FFPE. Le système ne nécessite pas de solvant organique, ce qui le rend sûr et pratique à utiliser, et l'ADN purifié peut être utilisé directement dans une variété d'applications en aval, y compris la PCR et le NGS.

Le système d'isolement Maxwell® HT DNA FFPE purifie l'acide nucléique à l'aide de particules paramagnétiques, qui fournissent une phase solide mobile pour optimiser la liaison, le lavage et la purification de l'ADNg. L'utilisation de particules paramagnétiques pour l'isolement de l'ADN élimine le besoin de centrifugation ou de collecteurs à vide, ce qui rend le système adapté à une automatisation complète.

Comme les échantillons FFPE peuvent avoir une qualité très variable en raison de la nature du processus de fixation et d'enrobage des échantillons, le CQ des échantillons peut être une partie importante du flux de travail FFPE.

Figure 12. Données comparatives de la chimie Maxwell® RSC DNA FFPE versus la chimie Maxwell® RSC FFPE Plus DNA. Il a été observé que la méthode Maxwell® RSC FFPE Plus DNA produit plus de rendement par absorbance et fluorescence, tandis que la méthode Maxwell® RSC DNA FFPE produit plus de rendement par PCR.

Spectrophotométrie est un moyen courant d'évaluer la qualité de l'ADN et de l'ARN extraits. La plupart des laboratoires ont un spectrophotomètre à microvolume NanoDrop (ou un appareil similaire) et ils sont incroyablement faciles à utiliser. Pipettez 1 à 2 µl d'échantillon, sélectionnez « Analyser » et l'instrument fournit une lecture de la concentration et de la pureté via A260/UNE280 et un260/UNE230 ratios en quelques secondes seulement. Ces appareils ont révolutionné la quantification des échantillons de routine en laboratoire, mais est-ce la meilleure méthode pour évaluer les échantillons FFPE ? Il y a deux considérations principales lors de l'utilisation d'un NanoDrop : la sensibilité et l'intégrité. Les échantillons FFPE peuvent avoir un large rendement d'ADN ou d'ARN, souvent aussi faible que 10 ng ou moins dans un volume allant de 10 µl à 100 µl à partir d'une extraction. Cela peut entraîner des concentrations d'échantillon inférieures à la plage linéaire du NanoDrop. De plus, en tant que spectrophotomètre, il ne fait pas la différence entre l'ARN, l'ADN ou les nucléotides libres, ce qui peut entraîner des imprécisions dramatiques dans les mesures de concentration d'ADN/ARN. Enfin, il n'y a aucun moyen de déterminer si un échantillon est accessible aux tests enzymatiques en aval car il ne peut pas détecter la présence ou l'absence de réticulations (ou d'autres dommages) dans un échantillon.

Quantification à base de colorant comme le système Promega QuantiFluor® dsDNA (Cat. # E2670, E2671), fournit une méthode rapide et nettement plus sensible pour quantifier l'ADNdb ou l'ARN par rapport à la spectroscopie d'absorbance. Cette méthode fournit une estimation largement utile de la concentration. Lors de l'examen des échantillons FFPE, il est important de noter que la quantification à base de colorant n'estime pas l'intégrité de l'ADN/ARN ou l'étendue de la réticulation dans l'échantillon, ce qui pourrait affecter le succès des tests en aval.

Essais de dimensionnement (par exemple, gel d'agarose, station de bande, analyseur de fragments, DV200) peut fournir une estimation de la concentration et, plus important encore, des informations sur la distribution de la taille des fragments dans l'échantillon. L'ADN dérivé de la FFPE, en raison du processus de fixation, peut être considérablement fragmenté par rapport à l'ADN provenant de tissus fraîchement congelés. Vous trouverez ci-dessous une trace d'analyseur de fragments (figure 13) et les scores DV200 associés (tableau 3) d'ADN isolé à partir de sections FFPE à l'aide de cinq méthodes de purification différentes. Bien que les traces de dimensionnement évaluent la distribution de la taille de l'ADN purifié, elles ne mesurent pas le degré de réticulation au sein de l'échantillon ou la présence d'inhibiteurs.

Figure 13. Trace d'analyseur de fragments d'ADN isolé à partir de sections FFPE en utilisant cinq méthodes de purification différentes.

Tableau 3. Scores DV200 d'ADN isolé à partir de sections FFPE en utilisant cinq méthodes de purification différentes dans la trace de l'analyseur de fragments (Figure 13).

Méthode 1 (vert clair) 2 (Bleu) 3 (rouge) 4 (orange) 5 (Vert)
DV200 71.8 69.9 70.1 58.7 80.5

Par exemple, lorsque les mêmes échantillons ont été quantifiés par des tests qPCR de différentes cibles et tailles de fragments, le rendement par qPCR n'est pas bien corrélé avec les scores DV200. En fait, dans cet exemple, les échantillons avec les scores DV200 les plus bas avaient le rendement le plus élevé par qPCR (Figure 14).

Figure 14. Rendements qPCR d'ADN isolé à partir de sections FFPE. Les mêmes échantillons d'ADN isolés par cinq méthodes de purification différentes dans la trace de l'analyseur de fragments et le tableau DV200 ci-dessus ont été quantifiés par des tests qPCR de différentes cibles et tailles de fragments.

Bien qu'il existe des tendances générales, le score DV200 n'est pas nécessairement en corrélation avec le succès des tests en aval tels que la qPCR.

qPCR présente plusieurs avantages pour la quantification des échantillons FFPE. Premièrement, la qPCR peut être très sensible, ne nécessitant qu'une petite quantité d'échantillon et détectant des quantités de pg/µl d'ADN. En termes de sensibilité dans la détection d'acide nucléique, elle n'est dépassée que par la ddPCR. La qPCR peut également fournir une mesure de la dégradation ou de la réticulation d'un échantillon d'ADN, car l'acide nucléique doit être un substrat approprié pour une ADN polymérase pour qu'un signal soit généré. L'absorbance peut ne pas représenter l'échantillon approprié pour l'analyse en aval car elle détectera l'ADN, l'ADN fragmenté et les nucléotides. Enfin, la plupart des tests qPCR QC, tels que le test ProNex® DNA QC (Cat.# NG1004, NG1005) fournissent des contrôles internes qui sont utilisés pour détecter la présence d'inhibiteurs dans l'échantillon avant de tenter un test plus coûteux. Cela peut vous aider à évaluer non seulement l'intégrité des acides nucléiques, mais également la probabilité de réussite d'un test basé sur l'amplification.

NGS est un autre test utilisé par certains laboratoires pour contrôler leurs échantillons. Il y a plusieurs raisons à cela. Certains laboratoires essaient d'obtenir autant de données que possible à partir d'échantillons très précieux, auquel cas toute information de séquence peut valoir la dépense et le risque d'échec des analyses de séquençage. En tant que test de contrôle qualité, le NGS peut fournir de nombreuses informations, mais il est coûteux et peut nécessiter de grandes quantités d'échantillons et de temps. Certains laboratoires utilisent un NGS passe-bas, qui utilise des échantillons hautement multiplexés pour réduire le coût par échantillon afin de déterminer s'il vaut la peine de consacrer du temps et des ressources à un séquençage plus approfondi.La plupart des fournisseurs de séquençage et de purification recommandent des tests qPCR pour quantifier l'ADN FFPE, car tous les flux de travail NGS dépendent principalement du succès des étapes d'amplification enzymatique pour obtenir un ADN prêt pour le séquençage dans le cadre des étapes de préparation de la bibliothèque.

Tableau 4. Avantages et inconvénients comparatifs de divers tests de CQ.

Méthode La vitesse Sensibilité Quantitatif? Mesurer la pureté ? Évaluer la taille de NA ? Détecter la réticulation ? Coût
Spectrophotométrie (NanoDrop) +++ + Semi - quantitatif + - - $
Quantification à base de colorant +++ ++ Oui - - - $
DV200 ++ + Semi - quantitatif - +* - $$
Électrophorèse sur gel ++ +/- Semi - quantitatif - +* - $
qPCR ++ +++ Oui +* + + $
NGS + Oui + ++ + $$$

Isolement de l'ADN génomique des plantes

Le Wizard® Magnetic 96 DNA Plant System (Cat.# FF3760, FF3761) est conçu pour la purification manuelle ou automatisée à 96 puits de l'ADN des feuilles de plantes et des tissus de graines. Le Wizard® Magnetic 96 DNA Plant System a été validé avec des feuilles de maïs et de tomate ainsi qu'avec des graines de canola et de tournesol. L'ADN purifié à partir de ces échantillons peut être utilisé dans la PCR et d'autres applications plus exigeantes, telles que l'analyse RAPD. Étant donné que les matières végétales peuvent être particulièrement difficiles à lyser, en particulier lorsque vous travaillez avec des tissus durs ou ligneux, l'équipement supplémentaire requis comprend non seulement un aimant (MagnaBot® FLEX 96 Magnetic Separation Device, Cat. # VA1920) mais également un dispositif capable de briser les graines ou un matériau de feuille (par exemple, Geno/Grinder® 2000 de SPEX CertiPrep, Inc.).

Le rendement dépend du matériel source et de la qualité de la pulvérisation des graines ou des disques foliaires avant l'isolement de l'ADN génomique. Le rendement peut aller de 10 à 100 ng à partir d'un seul emporte-pièce de 8 mm. Pour augmenter le rendement du Wizard® Magnetic 96 DNA Plant System, une mise à l'échelle en volume avec jusqu'à 5 poinçons de feuilles peut être utilisée [comme démontré dans Notes de Promega 79]. La mise à l'échelle potentielle est limitée par le volume dans une plaque à 96 puits à puits profonds.

Une autre option automatisée que nous avons pour répondre à vos besoins d'extraction d'ADN végétal est le kit Maxwell® RSC Plant DNA (Cat.# AS1490). Le kit Maxwell® RSC Plant DNA est utilisé avec les instruments Maxwell® RSC et RSC 48 pour fournir une méthode simple de purification efficace et automatisée de l'ADN génomique (ADNg) à partir d'une gamme d'échantillons de tissus végétaux, y compris le maïs, le soja et Arabidopsis. Les instruments sont fournis avec des méthodes de purification préprogrammées et utilisent des cartouches de réactifs prédistribuées, maximisant ainsi la simplicité et la commodité.

En utilisant ce système, l'ADN peut être purifié à partir d'échantillons de plantes en moins de 60 minutes avec un prétraitement minimal et aucune extraction organique. La purification automatisée permet une purification cohérente, avec moins de variabilité que les méthodes d'extraction d'ADN traditionnelles telles que CTAB et les colonnes de centrifugation. L'ADN purifié résultant est prêt à être utilisé dans des applications en aval, y compris des tests d'amplification.

Isolement de l'ADN génomique sérum-plasma

Pour un ADN acellulaire purifié de haute qualité à partir d'échantillons de plasma, nous proposons le kit Maxwell® RSC ccfDNA Plasma (Cat.# AS1480). En utilisant le protocole simple en trois étapes, l'instrument Maxwell® RSC peut traiter de 1 à 16 échantillons et l'instrument Maxwell® RSC 48 peut traiter de 1 à 48 échantillons. Ajoutez simplement 0,2 à 1,0 ml de plasma aux cartouches préparées et sélectionnez Démarrer, aucun prétraitement des échantillons requis. En 70 minutes environ, vous obtiendrez des rendements élevés d'ADN amplifiable prêt à être utilisé dans des tests en aval, notamment la qPCR, la NGS et la PCR numérique.

En tant que dispositif de déplacement de particules magnétiques, et non de traitement de liquides, le Maxwell® RSC offre en outre plusieurs avantages par rapport aux autres systèmes automatisés. Étant donné qu'aucune manipulation ou éclaboussure de liquide ne se produit pendant le traitement de l'échantillon, le risque de contamination croisée de l'échantillon est minime. Il élimine également le souci des blocages potentiels et des pannes inévitables du système qui s'ensuivent, garantissant un flux de travail fluide avec moins de perturbations.

Isolement de l'ADN génomique bactérien

Si vous devez prendre des décisions rapides concernant la contamination et la détérioration potentielles des aliments, le kit Maxwell® RSC PureFood Pathogen (Cat.# AS1660) offre un protocole automatisé simple avec un minimum d'étapes pratiques. Le kit élimine efficacement les étapes laborieuses de prétraitement des échantillons telles que le prétraitement enzymatique, car il fonctionne avec des types d'échantillons inhibiteurs et a également la capacité de lyser les bactéries Gram+ ou Gram–.

En couplant les produits chimiques Maxwell® hautes performances avec les instruments de paillasse Maxwell® RSC de confiance, vous serez en mesure de purifier efficacement l'ADN bactérien de jusqu'à 48 échantillons d'aliments en aussi peu que 40 minutes. Une fois extrait, l'ADN résultant est prêt pour des analyses moléculaires avancées en aval, y compris le sérotypage, le NGS et l'identification des organismes d'altération.

Cette méthode peut être utilisée à la fois pour les aliments crus et transformés et a été utilisée avec succès pour isoler l'ADN pathogène d'une grande variété d'échantillons d'aliments, y compris E. coli 0157:H7 de bœuf cru, Salmonella enterica de poulet cru et Listeria monocytogenes à partir de lait entier. La figure 15 ci-dessous met en évidence une comparaison de l'ADN total par rapport à E. coli 0157:H7 ADN extrait d'échantillons de coriandre qui ont été enrichis avec le E. coli 0157:Bactérie H7.

Figure 15. Comparaison de l'ADN total et E. coli 0157:H7 ADN extrait d'échantillons de coriandre dopés avec les quantités indiquées de E. coli 0157 : bactéries H7. La concentration totale d'ADN a été évaluée à l'aide du système QuantiFluor® ONE dsDNA.

Isolement de l'ADN génomique de Buffy Coat

Le kit Maxwell® RSC Buffy Coat DNA (Cat.# AS1540) fournit une méthode simple et automatisée d'extraction d'ADN génomique à l'aide du format pratique de cartouche préremplie de l'instrument Maxwell® RSC. Le kit contient tous les réactifs dont vous avez besoin pour une extraction optimale de l'ADN, et est compatible avec le sang stocké dans les anticoagulants EDTA, héparine et citrate. Évitez les tracas fastidieux et chronophages du prétraitement des échantillons, ajoutez simplement 50 à 250 μl de votre échantillon directement dans le puits n ° 1 des cartouches. Votre ADN purifié est prêt à être analysé en 50 minutes environ et peut être utilisé directement dans diverses applications en aval, telles que l'électrophorèse sur gel d'agarose.

Isolement de l'ADN génomique alimentaire

Les aliments et les matières végétales constituent souvent le plus grand défi pour la lyse cellulaire et l'extraction d'ADN intact, en raison des conditions de lyse requises pour libérer l'acide nucléique et la transformation des matières végétales en aliments.

Un autre système spécialisé d'isolement d'ADN génomique est le Wizard® Magnetic DNA Purification System for Food (Cat.# FF3750, FF3751). Ce protocole pratique est conçu pour la purification manuelle de l'ADN à partir d'une variété d'échantillons alimentaires, notamment des graines de maïs, de la semoule de maïs, du soja, de la farine de soja et du lait de soja, générant des résultats dans un tiers du temps des méthodes traditionnelles. De plus, l'ADN peut être purifié à partir d'aliments transformés tels que les chips de maïs, le chocolat et les aliments contenant du chocolat, la lécithine et les huiles végétales s'il est utilisé avec les protocoles optimisés appropriés.

L'ADN purifié de bon nombre de ces échantillons peut être utilisé dans des tests basés sur la PCR pour les séquences d'ADN d'organismes génétiquement modifiés (OGM), comme par une analyse quantitative à l'aide des tests TaqMan®. Comme pour tous les systèmes d'isolement utilisant les PMP MagneSil®, un support de séparation magnétique est nécessaire et permet de traiter jusqu'à 12 échantillons par lot. Avec des échantillons contenant des aliments hautement transformés, l'ADN génomique isolé sera fragmenté et mieux adapté à une analyse utilisant l'amplification plutôt qu'un transfert de Southern. Le rendement en ADN de ce système variera en fonction du type de source et de l'étendue de la transformation des aliments.

Le kit d'authentification et d'OGM Maxwell® RSC PureFood (Cat.# AS1600) fournit une méthode simple et automatisée pour une purification efficace de l'ADN pour l'authentification des aliments et des ingrédients par PCR. Le kit est utilisé avec les instruments Maxwell® RSC et RSC 48 et peut purifier l'ADN d'échantillons d'aliments crus et transformés, y compris le maïs, le soja, le canola, le bœuf haché et le porc haché.

Un protocole de 100 minutes ne nécessite que 30 minutes de travail pratique, ce qui permet d'obtenir non seulement des résultats plus rapides avec une automatisation autonome, mais également de libérer des ressources de laboratoire pour des activités à plus forte valeur ajoutée. L'ADN purifié extrait à l'aide du kit PureFood est prêt à être utilisé pour plusieurs applications, notamment la PCR en temps réel, l'électrophorèse sur gel, le séquençage de nouvelle génération et Sanger et les puces à ADN.

Protocoles de purification d'acide nucléique pour les types d'échantillons de plantes et d'aliments

Explorez notre collection de protocoles pour l'extraction manuelle et automatisée d'ADN ou d'ARN à partir d'une variété d'échantillons d'aliments et de plantes.


Aperçu expérimental

Les procédures actuelles consistent à isoler l'ADN plasmidique et à digérer l'ADN avec des enzymes de restriction. Assurez-vous d'utiliser la pipette appropriée et de régler le volume correctement et si vous n'êtes pas sûr, demandez. Enregistrez toutes les procédures et données dans votre cahier de laboratoire, en indiquant que &ldquowho&rdquo a effectué une étape de procédure spécifique, remettez des copies des pages du cahier à la fin de la session de laboratoire.

REMARQUE SPÉCIALE : Enregistrez suffisamment de détails sur les procédures dans votre cahier pendant le laboratoire aujourd'hui afin que vous puissiez répéter ces procédures en utilisant votre cahier comme seule ressource. Écrivez les méthodes dans le tien mots (c'est-à-dire, ne vous contentez pas de &ldquocopier&rdquo les étapes des pages Web ou des documents).

DÉTAILS SUPPLÉMENTAIRES : pour chaque centrifugation, enregistrez le temps, le rcf (# x g) et la température dans votre laboratoire NB TOUTES les centrifugations effectuées dans le microcentrifugeuses sont à &ldquotempérature&rdquo (indiquer comme tel mais pas besoin de déclarer en degrés C)

A) Mini préparation d'ADN plasmidique

  • Élimination des déchets : jetez le surnageant bactérien et récupérez les pointes contaminées dans un petit bécher.
  • Placer les tubes de culture dans le sac transparent Biohazards, ces sacs seront autoclavés avant d'être placés dans les ordures ménagères
  • Une fois les bactéries lysées, les pointes, flacons et autres matériaux doivent être jetés dans la poubelle et l'évier ordinaires

B) Digestion par enzymes de restriction (RE) de l'ADN plasmidique

Juste pour le fun

Nous tenons à remercier New England Biolabs pour leur généreux soutien à notre programme de laboratoire


Voir la vidéo: Extraction de la molécule dADN de cellules végétales (Mai 2022).


Commentaires:

  1. Sarr

    Bravo, je pense que c'est une pensée merveilleuse.

  2. Aoidh

    Tout à fait exact ! L'idée est bonne, je la soutiens.

  3. Moki

    Je m'excuse, mais cette variante ne me convient pas.Qui d'autre peut respirer?



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