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Spécificité de la nucléase à doigt de zinc

Spécificité de la nucléase à doigt de zinc


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Si je veux m'assurer qu'un ZFN ne coupe qu'à une certaine position dans un génome, de combien de sous-unités aurais-je besoin pour m'en assurer ?

Si le génome humain compte environ 3 milliards de paires de bases, nous avons besoin d'une séquence de 16 paires de bases car 4^16 dépasse 3 milliards (si mes pensées sont correctes). Mais alors je ne comprends pas très bien comment les sous-unités de la ZFN entrent dans cela.


Le génome diploïde humain est d'environ 6,5 milliards de pb, vous devez donc trouver la longueur d'une séquence qui a une probabilité de ne se produire qu'une seule fois (en supposant que la séquence soit complètement aléatoire) :

$4^n=6.5cdot10^9$

$ncdot log(4)=log(6.5)+9$

$n=frac{log(6.5)+9}{log(4)}$

$nenviron16.30$

Selon cet article, chaque doigt d'un ZFN reconnaît 3 pb, ce qui signifie que vous auriez besoin de $frac{18}{3}=6$ doigts pour reconnaître de manière probabiliste un site unique. Fait intéressant, l'article dit aussi :

L'exigence de dimérisation est un grand avantage pour cette raison : parce qu'un monomère n'est pas actif, le clivage ne se produit pas au niveau des sites de liaison uniques. Le réactif de clivage n'est assemblé au niveau de la cible que si les doigts ont une spécificité adéquate, et l'exigence combinée de liaison de deux protéines amène la spécificité globale dans une plage très utile ; par exemple, deux protéines à trois doigts spécifient l'emplacement de 18 pb, ce qui est suffisant, en principe, pour sélectionner une cible unique, même dans un génome complexe.


Biocompatibilité, ingénierie de surface et administration de médicaments, de gènes et d'autres molécules

4.32.1.2.2 Nucléases à doigts de zinc

Les nucléases à doigt de zinc (ZFN) ont été le premier système de protéine de liaison à l'ADN programmable largement utilisé. 11 ZFN sont constitués d'une chaîne de protéines à doigt de zinc fusionnée à une nucléase bactérienne pour produire un système capable de créer des cassures d'ADN double brin spécifiques à un site pour permettre des modifications de gènes (Fig. 1(A)). Les protéines à doigt de zinc fournissent un ciblage spécifique au site car elles reconnaissent chacune une séquence d'ADN de 3 à 4 paires de bases. 6,12 Dans les ZFN, une chaîne de protéines à doigt de zinc est utilisée pour reconnaître un locus plus long et plus spécifique dans le génome. La nucléase couramment utilisée en technologie ZFN, fusionnée à cette chaîne de protéines à doigt de zinc, est la FokI, qui doit se dimériser pour introduire un DSB. 13 Par conséquent, une paire de ZFN est utilisée ensemble pour cibler et couper l'ADN 14 (Fig. 1(A)). Comme décrit ci-dessus, l'introduction d'un DSB active la voie native de réponse aux dommages de l'ADN, permettant l'introduction de modifications génétiques spécifiques par HDR. 15,16 ZFN ont été appliqués avec succès à l'édition de gènes dans des cellules souches somatiques 17 et pluripotentes humaines. 18 Les ZFN présentent cependant un inconvénient inhérent. À savoir, l'assemblage de domaines à doigts de zinc en tandem dans une chaîne à haute affinité est un défi. De plus, les procédures de laboratoire se sont avérées chronophages pour tout travailleur de laboratoire qui n'est pas un spécialiste de la ZFN, ce qui nécessite un effort considérable pour produire un contrôle efficace. Un avantage principal du système ZFN est l'utilisation de FokI dimérisé, qui peut augmenter la spécificité du ciblage de l'ADN et réduire les effets hors cible.


Fond

Le virus de l'herpès simplex de type II comme cause de maladie ulcéreuse génitale humaine

Les virus de l'herpès simplex de types I et II (HSV-1 et 2, respectivement), ainsi que le virus varicelle-zona (varicelle), sont membres de la herpesviridae famille taxonomique de virus [1]. L'infection humaine par ces virus largement neurotropes peut être active ou latente [1, 2]. L'infection active par HSV-1 ou HSV-2 entraîne des lésions ulcéreuses de la muqueuse buccale ou génitale, respectivement [3, 4] l'infection latente par ces espèces virales est largement asymptomatique. L'infection latente à HSV-2 se produit principalement dans les neurones des ganglions de la racine sacrée. Par conséquent, on peut dire que le spectre clinique du HSV-2 comprend une infection primaire-active, suivie de la résolution et de l'établissement d'une phase de latence à vie [4, 5]. L'infection primaire à HSV-2 est caractérisée par l'apparition de cloques ou de vésicules sur la vulve ou le pénis qui se brisent pour laisser des lésions ulcéreuses peu profondes et douloureuses [6, 7]. Ces ulcères guérissent spontanément en 2-3 semaines, bien que la guérison puisse être très lente chez les patients immunodéprimés [7]. Latent-HSV-2 est caractérisé par des épisodes récurrents de maladie clinique (4-5 par an) le statut subclinique intermittent entre les épisodes de réactivation peut être associé à l'excrétion virale infectieuse et à la transmission du HSV-2 dans les sécrétions génitales. L'incidence des infections symptomatiques à HSV-2 varie géographiquement mais est plus élevée chez les personnes séropositives [8–10]. Les lésions génitales associées à l'infection active à HSV-2 sont devenues un problème de santé publique particulier, car il existe des preuves qui les relient à un risque accru d'acquisition sexuelle ou de transmission du virus de l'immunodéficience humaine de type I (VIH-1) [5-8 ]. Par conséquent, le traitement du HSV-2 et d'autres maladies ulcéreuses génitales [9] est une mesure acceptable lorsqu'on envisage de réduire le risque de transmission et d'acquisition sexuelles du VIH-1 [10–12].

Défis des options existantes pour le traitement ou la prévention de l'acquisition du HSV-2

Les interventions biomédicales existantes pour le traitement du HSV-2 ne s'appliquent qu'à la réplication active des particules de HSV-2 [13]. Cela limite leur pertinence clinique au seul traitement des lésions ulcéreuses du HSV-2 [14, 15], plutôt qu'à l'élimination de l'infection. Plus précisément, les options de chimiothérapie existantes pour le traitement du HSV-2 n'inhibent que le virus à réplication active, tandis que le virus latent n'est pas affecté. Cependant, le HSV-2 latent est à l'origine de futurs épisodes d'ulcérations génitales suite à une réactivation pendant ou à la suite d'un épisode d'immunosuppression causée par un rhume, après une infection par le VIH ou un traitement de chimiothérapie, entre autres [16, 17]. Cette image d'une infection latente à vie qui peut être réactivée présente des défis uniques pour la gestion biomédicale des infections à HSV-2 [18]. Des efforts substantiels ont été déployés pour développer un vaccin efficace contre le HSV-2 sur la base des preuves biomédicales existantes, et ils sont en cours [19, 20]. Plus précisément, des essais cliniques randomisés de candidats vaccins antérieurs contre le HSV-2, comprenant des glycoprotéines recombinantes à un ou deux composants (gB2 et gD2) formulées dans des adjuvants ou exprimées dans des incompétences pour la réplication vivantes atténuées (disable-infectieux à cycle unique-DISC, mutation du gène ICP8 ) ou des vecteurs viraux dérivés du HSV-2 capables de se répliquer (mutation du gène ICP10), n'ont démontré qu'une efficacité partielle vis-à-vis de l'objectif final de protection contre la transmission sexuelle ou l'acquisition du HSV-2 [21–25].

-Virologie du HSV-2 et le concept de pré-intégration viral-génome slicing (PRINT-vGSX)

Comme les autres membres génériques de la alphaherpesviridae sous-famille, HSV-2 est un grand virus enveloppé avec une enveloppe lipidique externe parsemée d'au moins 10 glycoprotéines virales, une couche intermédiaire de tégument comprenant au moins 15 protéines virales et une nucléocapside icosaédrique contenant le génome d'ADN double brin [26]. Le génome séquencé complet d'une souche de HSV-2, HG52 (Dolan et al.[27]), révèle que l'ADN génomique du HSV-2 est organisé en deux régions uniques d'ADN double brin (long de 126 kb et court de 26 kb) désignées par UL et toiS. Celles-ci sont encadrées par des séquences répétées inversées (TRL-IRL et IRS-TRS) qui permettent facilement l'isomérisation et la recombinaison des deux régions [27, 28]. L'ensemble du génome a une teneur en G+C de 70,4 % et comprend 84 cadres de lecture ouverts codant environ 74 protéines qui peuvent être regroupées en trois catégories : (i) gènes immédiats-précoces (dont la transcription dépend d'une protéine d'activation virale, VP16, et qui code pour les protéines virales α) (ii) premiers gènes (qui sont activés par les protéines et dont les produits (protéines β) sont impliqués dans la réplication de l'ADN) et (iii) gènes tardifs, dont les produits (protéines γ) sont des protéines structurelles du virion et des protéines nécessaires à l'assemblage et à la sortie des particules virales. La majorité des glycoprotéines de l'enveloppe virale (gD) sont antigéniquement apparentées à celles du HSV-1, tandis que gG1 et gG2 sont spécifiques de type [27, 29]. Cette gamme de nombreux produits génétiques, dont beaucoup sont indispensables à la croissance du virus in vitro, sous-tend la virulence efficace évoluée par HSV-2 vers l'évasion des défenses de l'hôte, y compris la prévention de l'apoptose dans la cellule hôte infectée, le blocage des voies d'induction et de production d'interféron, et la régulation négative de la présentation de l'antigène HSV-2 dans le contexte du type I Complexe majeur d'histocompatibilité (CMH) [30].

Sur la base du linéaire double brin (ds) La structure génomique de l'ADN du HSV-2 [27] et le fonctionnement de la défense anti-phage primitive inhérente aux bactéries, le système de restriction de modification (RM), la possibilité d'attaquer directement et de perturber ou d'exciser l'ADN génomique du HSV-2 a été proposé comme une nouvelle intervention biomédicale alternative contre le HSV-2 [31]. Plus précisément, nous avons démontré que la Escherichia coli L'enzyme de restriction (REase)-EcoRII, qui clive le génome du HSV-2 à plus de 800, est un précurseur idéal pour exciser des sections de génomes de particules de HSV-2 infectieuses (à réplication active) ou pour perturber de manière irréversible l'ADN génomique latent du HSV-2 à partir de au sein des cellules infectées. Il a été noté que les séquences du palindrome de spécificité de site d'EcoRII 5'-CCWGG-3' (W = A ou T) étaient répandues dans le génome humain-hôte et donc une source de toxicité hôte-génome. Cette découverte a limité les modèles thérapeutiques basés sur le HSV-2/EcoRII aux microbicides uniquement [32, 33] et a mis en évidence la nécessité de concevoir des REases artificielles (ou des nucléases à doigt de zinc - ZFN) [34-36] avec une spécificité unique pour les séquences génomiques du HSV. -2 comme précurseurs sûrs pour l'exploration thérapeutique in vivo. Grosse et al.[37], ont récemment identifié de telles endonucléases (méga-) autodirectrices spécifiques du HSV-1, démontrant que leur expression dans le fibroblaste du rein du singe vert africain (COS-7) et les cellules BSR inhibe l'infection par le HSV-1 à des multiplicités d'infection faibles et modérées ( MOIs), induisant une réduction significative de la charge virale. De plus, les génomes viraux restants présentent un taux élevé de mutation (jusqu'à 16 %) au site de clivage de la méganucléase, ce qui correspond à un mécanisme d'action basé sur le clivage du génome viral. Ce travail a mis en évidence les méganucléases (et à doigt de zinc) comme une classe alternative d'agents antiviraux ayant le potentiel de traiter les formes virales à ADN réplicatives et latentes [37].

Dans cet article, l'identification, l'assemblage et la modélisation des in vivo Le potentiel thérapeutique des puces à doigts de zinc (ZFA), des ZFN et des vecteurs viraux transduisant le génotype ZFN, avec une spécificité unique aux séquences du génome du HSV-2, est présenté pour la première fois.


Comparaison des nucléases à doigt de zinc et des nucléases spécifiques à CRISPR pour l'édition du génome du locus du syndrome de Wiskott-Aldrich

Les immunodéficiences primaires, y compris le syndrome de Wiskott-Aldrich (WAS), sont une cible principale pour les stratégies d'édition du génome utilisant des nucléases spécifiques (SN) car un petit nombre de cellules souches hématopoïétiques corrigées pourraient guérir les patients. Dans ce travail, nous avons conçu divers systèmes CRISPR/Cas9 spécifiques au gène WAS et comparé leur efficacité et leur spécificité avec des nucléases à doigt de zinc homodimères et hétérodimériques spécifiques à WAS (ZFN), en utilisant des cellules K-562 comme modèle cellulaire et une nucléofection ou intégration de plasmides. -vecteurs lentiviraux déficients (IDLV) pour la livraison. Les différents SN CRISPR/Cas9 et ZFN ont montré une efficacité similaire lors de l'utilisation de la nucléofection plasmidique pour la livraison. Cependant, les IDLV doubles exprimant les ZFN étaient plus efficaces que les IDLV doubles exprimant Cas9 et l'ARN guide ou les IDLV tout-en-un, exprimant Cas9 et l'ARN guide dans le même vecteur. La spécificité des ZFN hétérodimériques et CRISPR/Cas9, mesurée par des incréments dans la formation de foyers γ-H2AX dans les cellules éditées par WAS, était similaire pour les deux, et les deux ont surpassé les ZFN homodimériques indépendamment du système d'administration utilisé. Fait intéressant, nous montrons que la livraison de SN, en utilisant des IDLV, est plus efficace et moins génotoxique que la nucléofection plasmidique. Nous montrons également le comportement similaire des ZFN hétérodimériques et de CRISPR/Cas9 pour les stratégies de knock-in de gènes dirigées par homologie, avec 88 et 83 % des donneurs insérés dans le locus WAS, respectivement, alors que lors de l'utilisation de ZFN homodimériques, seulement 45 % des insertions étaient sur la cible. En résumé, nos données indiquent que CRISPR/Cas9 et les ZFN hétérodimériques sont tous deux de bonnes alternatives pour développer davantage les stratégies de thérapie génique basées sur le SN pour le WAS. Cependant, la livraison IDLV de ZFN hétérodimères spécifiques à WAS était la meilleure option de tous les systèmes comparés dans cette étude.

Mots clés: CRISPR/Cas9 K562 Syndrome de Wiskott-Aldrich édition du génome vecteurs lentiviraux déficients intégratifs (IDLV) nucléases à doigt de zinc (ZFN).


Résumé

Le transfert de gènes de récepteurs de cellules T de haute avidité (TCR) isolés de lymphocytes spécifiques de tumeurs rares dans des cellules T polyclonales est une stratégie d'immunothérapie anticancéreuse intéressante. Cependant, le transfert de gènes TCR entraîne une compétition pour l'expression de surface et un appariement inapproprié entre les chaînes TCR exogènes et endogènes, entraînant une activité sous-optimale et des spécificités antigéniques imprévues potentiellement nocives des TCR résultants. Nous avons conçu des nucléases à doigts de zinc (ZFN) qui ont favorisé la perturbation des gènes endogènes de la chaîne β et Î du TCR. Les lymphocytes traités avec les ZFN manquaient d'expression de surface de CD3-TCR et se sont développés avec l'ajout d'interleukine-7 (IL-7) et d'IL-15. Après transfert lentiviral d'un TCR spécifique de l'antigène de la tumeur de Wilms 1 (WT1), ces cellules modifiées par le TCR ont exprimé le nouveau TCR à des niveaux élevés, ont été facilement étendues à une pureté proche et étaient supérieures à la reconnaissance de l'antigène spécifique par rapport aux donneurs appariés, non édités Cellules transférées par TCR. Contrairement aux cellules transférées par TCR non éditées, les lymphocytes édités par TCR n'ont pas médié la réactivité hors cible tout en maintenant leur activité anti-tumorale in vivo, montrant ainsi que l'édition complète de la spécificité des cellules T génère des lymphocytes spécifiques à la tumeur avec des profils de biosécurité améliorés.


La découverte des doigts de zinc et leurs applications dans la régulation des gènes et la manipulation du génome

Un compte rendu est donné de la découverte de la Cys classique2Le sien2 doigt de zinc, résultant de l'interprétation d'études biochimiques sur l'interaction des Xénope facteur de transcription protéique IIIA avec ARN 5S, et d'études structurales sur sa structure et son interaction avec l'ADN. Le doigt est un domaine autonome stabilisé par un ion zinc lié à une paire de cystéines et une paire d'histidines, et par un noyau hydrophobe interne. Cette découverte a montré non seulement un nouveau repliement protéique, mais aussi un nouveau principe de reconnaissance de l'ADN. Alors que d'autres protéines de liaison à l'ADN utilisent généralement la symétrie double de la double hélice, les doigts de zinc peuvent être liés linéairement en tandem pour reconnaître des séquences d'acides nucléiques de longueurs variables. Cette conception modulaire offre un grand nombre de possibilités combinatoires pour la reconnaissance spécifique de l'ADN (ou ARN). Il n'est donc pas surprenant que le doigt de zinc se retrouve largement répandu dans la nature, incluant 3% des gènes du génome humain.


Développement de domaines en doigt de zinc pour la reconnaissance des séquences d'ADN de la famille 5'-CNN-3' et leur utilisation dans la construction de facteurs de transcription artificiels

Des progrès considérables ont été réalisés ces dernières années dans la conception de facteurs de transcription pour la régulation dirigée des gènes endogènes. Bien que de nombreuses stratégies impliquent des méthodes de sélection qui doivent être appliquées pour chaque nouvelle séquence cible, nous avons développé une approche basée sur la liaison de domaines à doigt de zinc prédéfinis qui reconnaissent chacun une séquence d'ADN à trois paires de bases pour construire des facteurs de transcription artificiels qui se lient à une séquence souhaitée. . Ces domaines peuvent être assemblés pour reconnaître des séquences d'ADN uniques de 18 paires de bases avec une spécificité élevée. Nous rapportons ici le développement et la caractérisation des domaines en doigt de zinc qui se lient à 15 des 16 sous-sites 5'-CNN-3'. Ces domaines ont été créés grâce à une combinaison de sélection de phage display, de mutagenèse dirigée et de conception de novo. De plus, ces domaines ont été utilisés pour générer une protéine à six doigts hautement spécifique ciblant le promoteur ERBB-2. Lorsqu'elle est fusionnée à des domaines régulateurs, cette protéine est capable de réguler à la hausse et à la baisse l'expression du gène ERBB-2 endogène. Avec l'ajout de cette collection de domaines à doigt de zinc prédéfinis, la plupart des séquences contenant 5'-CNN-3'-, 5'-GNN-3'- et 5'-ANN-3' peuvent désormais être rapidement ciblées pour le gène dirigé. régulation et clivage de la nucléase.


MATÉRIAUX ET MÉTHODES

Expériences de puces à ADN de liaison aux protéines

Les séquences des deux conceptions PBM « all-10-mer » sont données à l'adresse http://hugheslab.ccbr.utoronto.ca/supplementary-data/C2H2_modularity/. Les détails de la conception et de l'utilisation des PBM ont été décrits ailleurs (41, 47, 49, 50). Les plasmides sont répertoriés dans le tableau supplémentaire S1 . Les ZFA ont été clonés sous forme de fragments SacI-BamHI dans pTH5325, un vecteur d'expression GST modifié piloté par T7 (voir le document supplémentaire des données supplémentaires). Brièvement, nous avons utilisé 150 ng d'ADN plasmidique dans un 25 l in vitro réaction de transcription/traduction à l'aide d'un kit PURExpress In Vitro Protein Synthesis (New England BioLabs) complété par un inhibiteur de RNase et 50 M d'acétate de zinc. Après une incubation de 2 h à 37°C, 12,5 l du mélange ont été ajoutés à 137,5 l de solution de liaison aux protéines pour un mélange final de PBS/2% de lait écrémé/0,2 mg par ml de BSA/50 M d'acétate de zinc/0,1 % Entre 20 et 20. Ce mélange a été ajouté à une puce préalablement bloquée avec du PBS/2% de lait écrémé et lavé une fois avec du PBS/0,1% Tween-20 et une fois avec du PBS/0,01 % Triton-X 100. Après une incubation de 1 h à température ambiante, le la matrice a été lavée une fois avec du PBS/0,5% Tween-20/50 M d'acétate de zinc et une fois avec du PBS/0,01 % Triton-X 100/50 M d'acétate de zinc. Un anticorps anti-GST marqué au Cy5 a été ajouté, dilué dans du PBS/2% de lait écrémé/50 µM d'acétate de zinc. Après 1 h d'incubation à température ambiante, la puce a été lavée trois fois avec du PBS/0,05 % Tween-20/50 µM d'acétate de zinc et une fois avec du PBS/50 µM d'acétate de zinc. La puce a ensuite été imagée à l'aide d'un scanner de puces à ADN Agilent à une résolution de 2 M.

Analyse des données de microarray

Les intensités des spots d'images ont été quantifiées à l'aide du logiciel ImaGene (BioDiscovery). Pour estimer la préférence relative pour chaque 8-mer, deux scores différents ont été calculés : le Z-score a été calculé à partir de l'intensité moyenne du signal sur les 16 ou 32 spots contenant chacun 8-mer le 'E-score' (pour l'enrichissement) est une variation de l'aire sous la courbe ROC (41) et est utilisé ici car il est hautement reproductible et facilite la comparaison entre des expériences distinctes. Chaque ZFA a été testée sur deux puces universelles différentes (désignées ME et HK). E-les données de score sont discutées dans le texte cependant, les deux Z- et E-les données de score sont fournies dans les données supplémentaires en ligne à http://hugheslab.ccbr.utoronto.ca/supplementary-data/C2H2_modularity/. Les données des puces à ADN ont été déposées auprès de GEO (numéro d'accès GSE25723).


TALEN et ZFN

Le monde dispose désormais de deux technologies majeures pour l'édition ciblée du génome : les nucléases à doigt de zinc (ZFN) et les nucléases effectrices TAL (TALEN). En principe, ces technologies sont capables de cibler pratiquement n'importe quel site du génome et d'éditer l'ADN qui s'y trouve. Ceux-ci ont déjà commencé à révolutionner la recherche et la médecine, et leur potentiel dans les années à venir semble énorme, alors je me suis assis pour comprendre comment ils fonctionnent.

Le ciblage génique, bien qu'assez nouveau, n'est pas comme nouveau comme ZFN ou TALEN. À la fin des années 1980, Cappechi, Evans et Smithies ont découvert que le processus cellulaire de recombinaison homologue pouvait être détourné pour échanger l'ADN génomique contre une nouvelle séquence d'intérêt. La recombinaison homologue - où les enzymes échangent deux morceaux d'ADN similaires l'un pour l'autre - est un mécanisme natif de tous les organismes vivants. Les bactéries l'utilisent pour échanger des gènes utiles. Nous, les animaux, l'utilisons pour croiser nos paires de chromosomes pendant la méiose, ce qui est important car elle permet à la sélection naturelle d'agir sur des gènes individuels plutôt que sur des chromosomes entiers. Sinon, un gène vraiment bénéfique ne pourrait jamais bénéficier d'une sélection positive s'il se trouvait juste en aval d'un gène vraiment mauvais. Quoi qu'il en soit, Cappechi, Evans et Smithie ont compris que si vous pouviez simplement créer un ADN homologue (c'est-à-dire similaire, pas identique) à un gène existant dans un organisme et introduire cet ADN dans le noyau d'une cellule, ce qui nécessite une électroporation pour perméabiliser le membrane cellulaire - il y avait une chance qu'elle se recombine et soit intégrée dans le génome de la cellule. En appliquant cela aux cellules souches embryonnaires de souris et en recombinant des versions mutantes et non fonctionnelles de gènes dans le génome de la souris pour remplacer les gènes fonctionnels, ils ont inventé la souris knock-out, une réalisation qui leur a valu un prix Nobel en 2007.

Cette réalisation a été le fondement de presque toutes les génétiques inverses (c'est-à-dire créer un génotype, étudier le phénotype résultant) depuis lors. Mais juste croiser les doigts et espérer que l'ADN homologue se recombine est un processus assez inefficace - seule une très petite fraction des cellules obtient une recombinaison réussie.

Le processus est inefficace en partie parce que la recombinaison homologue nécessite que l'ADN subisse d'abord une cassure double brin à un endroit pertinent, puis les mécanismes de réparation doivent réparer cette cassure en fusionnant le nouvel ADN (plutôt que l'ancien) à l'extrémité cassée. . Donc, si vous deviez vous asseoir et réfléchir à des moyens d'essayer d'accélérer ce processus, vous pourriez avoir l'idée de couper d'abord l'ADN génomique, pour créer la rupture double brin.

La biologie dispose justement d'un tel mécanisme pour créer des cassures double brin : les enzymes de restriction. Certaines espèces de bactéries ont développé ces enzymes pour hacher l'ADN des bactériophages envahisseurs (virus qui infectent les bactéries). Les bactéries méthylent ces séquences de leur posséder ADN pour empêcher les tirs amis. Brillant. Depuis des décennies maintenant, nous, les humains, avons détourné ce mécanisme pour toutes sortes de protocoles biologiques. Si vous y repensez, vous vous souviendrez peut-être qu'avant le séquençage, nous les utilisions pour les empreintes génétiques dans les tests médico-légaux et de paternité. Les enzymes de restriction ont une résolution de nucléotide unique dans leur spécificité de liaison, donc un SNP peut faire la différence entre avoir un site de restriction et ne pas avoir de site de restriction. Par conséquent, si vous exposez l'ADN de deux personnes différentes à la même enzyme de restriction, il les coupera à des endroits différents, ce qui produira des fragments de longueurs différentes. Ces différences de longueur, appelées polymorphismes de longueur des fragments de restriction ou RFLP, figuraient en bonne place dans l'essai OJ.

Le problème avec les enzymes de restriction, c'est que leurs séquences de reconnaissance sont vraiment courtes, et par conséquent, toute enzyme de restriction donnée sera coupée à des centaines ou des milliers d'endroits dans le génome. Par exemple, les sites de reconnaissance des enzymes de restriction EcoRI et SamI :

Seulement six bases chacun. Ce qu'il fallait, à la place, c'était une enzyme de restriction qui reconnaîtrait une séquence beaucoup plus longue, suffisamment longue pour être unique à une position dans l'ensemble du génome.

Les méganucléases ne sont que cela. Malgré le préfixe, ils ne reconnaissent pas une séquence de 1 million de paires de bases, juste une séquence de 12 à 40 paires de bases, mais dans de nombreux cas, c'est déjà suffisant pour avoir un et un seul site de reconnaissance dans le génome d'un organisme entier. . Donc, si le site génomique que vous souhaitez cibler arrive porter la séquence reconnue par une méganucléase connue, alors vous êtes en affaires. Mais il y a 4 18 /2 séquences possibles de 18 paires de bases que vous voudrez peut-être cibler, et vous n'allez pas simplement tomber sur 4 18 /2 méganucléases différentes pour faire le travail. Les gens ont essayé d'utiliser des écrans de mutagenèse aléatoire pour générer de nouvelles méganucléases, avec un certain succès, mais nous sommes encore loin de pouvoir cibler seulement tout séquence possible.

Les méganucléases se sont avérées utiles et vous pouvez les acheter chez Cellectis aujourd'hui, elles ne sont en aucun cas hors de propos. Mais ils n'ont jamais révolutionné la science parce qu'ils n'étaient tout simplement pas assez programmables. Vous ne pouviez pas les concevoir à partir de zéro pour répondre à vos attentes.

Entrez dans le Cys2Le sien2 protéine à doigt de zinc. Ce sont des protéines de liaison à l'ADN spécifiques à une séquence qui agissent comme des facteurs de transcription, c'est-à-dire qu'elles régulent l'expression des gènes en se liant sélectivement aux promoteurs des gènes. De nombreuses espèces en possèdent, y compris nous, les humains (le gène EGR1 code un facteur de transcription à doigt de zinc). Mais alors que nous avons des milliers de facteurs de transcription qui ne sont pas plus "reprogrammables" qu'une méganucléase, la beauté du doigt de zinc est qu'il est modulaire. Chaque doigt de zinc a deux à quatre domaines, chacun avec une hélice qui s'insère dans le sillon principal d'une double hélice d'ADN et se lie sélectivement à une séquence de 3 paires de bases.

Les doigts de zinc les plus couramment utilisés ont trois "doigts" (domaines de liaison à l'ADN), ce qui signifie que vous avez une spécificité de 9 bases. Les protéines à doigt de zinc sont ensuite utilisées par paires, vous donnant une spécificité de 18 bases. C'est suffisant pour cibler de manière unique presque toutes les séquences que vous souhaitez.

Les doigts de zinc, à eux seuls, se lient à l'ADN. Donc, si tout ce que vous aviez à faire était de concevoir une protéine pour lier sélectivement un promoteur pour activer un gène, vous en avez terminé là. Mais si vous voulez les utiliser pour créer des ruptures ciblées dans l'ADN, vous avez besoin d'une paire de ciseaux pour les accompagner. Naturellement, vous cherchez une autre protéine de clivage de l'ADN ou un domaine d'une protéine que vous pourriez fusionner avec les doigts de zinc. Toutes les enzymes de restriction ont une capacité de clivage de l'ADN, mais vous savez à quel point le repliement des protéines est compliqué : la plupart d'entre elles ont la capacité de clivage de l'ADN, toutes liées à la capacité de liaison à l'ADN et vous ne pouvez pas séparer proprement les deux. Mais l'enzyme de restriction FokI, isolée par Sugisaki & Kanazawa 1981, a exactement ce dont vous avez besoin : un domaine de clivage de l'ADN qui n'a aucune spécificité de séquence et peut fonctionner complètement séparément du domaine de liaison à l'ADN de l'enzyme.

Imaginez maintenant deux protéines à doigt de zinc, chacune avec trois doigts pour un total de spécificité de 18 paires de bases, liées en amont et en aval d'un site d'intérêt, et chacune fusionnée à un domaine de clivage d'ADN FokI entre elles. C'est une nucléase à doigt de zinc. Les gens ont même pu faire en sorte que le domaine de clivage FokI sur chaque protéine soit légèrement différent et ne soit capable de cliver l'ADN que comme hétérodimères (combinaison des deux domaines FokI différents) plutôt que homodimères, pour réduire les effets hors cible. Vous pouvez également aller plus loin pour plus de spécificité : les ZFN personnalisés CompoZr, vendus par Sigma-Aldrich sous licence commerciale exclusive pour vendre des ZFN, reconnaissent 24 à 36 bases. (Soit dit en passant, bien que les ZFN soient brevetés, vous pouvez toujours légalement lancer le vôtre, et le Zinc Finger Consortium fournit des protocoles open source pour la synthèse des ZFN ainsi que des logiciels pour les concevoir.)

La conception des doigts de zinc pour cibler une séquence d'ADN spécifique n'est pas aussi parfaite ou élégante que vous pourriez l'espérer : essayez de rechercher sur Google ‘zinc finger code’ et voyez si vous avez plus de chance que moi. J'espérais un beau tableau montrant quelles séquences d'acides aminés dans l'hélice alpha correspondent à quels triplets de base d'ADN. Il semble que ce ne soit pas aussi simple, car les doigts interagissent les uns avec les autres et modifient les propriétés de pliage les uns des autres : « Dans les ZFP multi-doigts naturels et conçus, les doigts individuels ne fonctionnent pas toujours comme des unités complètement modulaires » [Blessé 2003]. Il y a donc encore un peu d'essais et d'erreurs et vous ne pouvez pas toujours cibler la séquence exacte que vous voulez et vous devrez peut-être vous contenter d'un autre site un peu loin de votre site idéal.

Malgré cela, les doigts de zinc se sont avérés assez révolutionnaires. Plus célèbre encore, ils ont joué un rôle dans l'une des avancées biologiques les plus impressionnantes de notre vie à ce jour : la thérapie génique par cellules souches pour le VIH. Au milieu des années 1990, les gens savaient que le VIH avait besoin de la protéine CD4 (présente sur les lymphocytes T CD4+) comme récepteur pour infecter les cellules. Samson 1996a a caractérisé le gène CCR5, qui s'est rapidement avéré être un corécepteur pour le VIH, le virus doit d'abord se lier au CD4, puis au CCR5 afin d'entrer dans les cellules T. Samson 1996b a découvert un allèle CCR5 où le produit du gène est complètement désactivé par une délétion de décalage de 32 pb (maintenant appelé allèle CCR5Δ32). Cet allèle a une fréquence d'environ 10% chez les Européens (invisible dans d'autres populations) et Samson a conclu qu'il doit conférer une résistance à l'infection par le VIH puisqu'aucune personne séropositive n'a été trouvée homozygote pour cet allèle dans 723 cas de VIH et même les hétérozygotes ont été épuisés d'environ 35%. Par conséquent, la suppression de CCR5 du génome semblait être une voie thérapeutique potentielle pour le VIH. En 2010, plusieurs groupes avaient pu démontrer chez la souris la faisabilité de l'utilisation des ZFN pour perturber le CCR5 et produire une résistance au VIH. Perez 2008 a utilisé des ZFN pour perturber le CCR5 dans les cellules T CD4+ humaines, réalisant une perturbation d'environ 50 % des allèles CCR5, puis a transplanté ces cellules dans des souris NOG immunodéficientes et a montré que les souris avec les cellules CD4+ perturbées par CCR5 produisaient moins de virus et maintenaient plus de nombre de cellules CD4+ (tous deux indicateurs de la gravité de l'infection par le VIH) que les souris témoins ayant reçu des cellules CD4+ non modifiées. Cette approche s'est rapidement transformée en un essai clinique qui est en cours (Voir aussi cette introduction auto-promotionnelle mais bien écrite à l'essai clinique par Sangamo, la société qui détient le brevet sur les ZFN) . Une autre approche consiste, au lieu de transplanter des cellules CD4+ modifiées, à modifier les cellules souches qui créent les cellules CD4+, créant ainsi un approvisionnement permanent de cellules résistantes au VIH. Holt 2010 a fait exactement cela en utilisant des cellules souches hématopoïétiques (hématopoïétiques) de sang de cordon humain, transfectées avec des ZFN ciblées pour perturber le CCR5 et transplantées dans des souris. Le VIH a rapidement tué la plupart des cellules non perturbées, laissant une population de cellules knock-out CCR5 homozygotes incapables d'être infectées. L'approche de Holt – utilisant des cellules souches – est similaire au cas de la personne qui a été (selon nous) complètement guérie du VIH. Allers 2011 rapporte le cas d'un patient atteint de leucémie séropositive qui a reçu une greffe de moelle osseuse d'un donneur compatible qui était un homozygote CCR5Δ32. Le patient semble désormais ne plus être infecté par le VIH. Personne n'a encore fait ce genre de transplantation avec les propres cellules modifiées par ZFN d'un patient, mais cela pourrait être la prochaine étape. (Ce type de procédure est limité aux patients qui ont déjà une leucémie potentiellement mortelle en plus du VIH, car les greffes de moelle osseuse sont incroyablement risquées).

Les nucléases à doigt de zinc ont toutes grandi à ce stade, ayant déjà fait l'objet d'un essai clinique. Mais tout le buzz en ce moment concerne une nouvelle alternative relativement non testée mais très prometteuse : les nucléases effectrices de type activateur de transcription, ou TALEN.

Comme les ZFN et la plupart des autres choses intéressantes en biologie, les humains n'ont pas inventé les TALEN à partir de zéro. Au lieu de cela, nous avons détourné des outils biologiques d'un organisme hautement spécialisé qui avait évolué pour faire ce que nous voulons faire. Les TALEN utilisent des protéines de liaison à l'ADN de la Xanthomonas genre de bactéries. Xanthomonas are plant pathogens that produce proteins to specifically bind to and up- or down-regulate promoter sequences in host genes important to the disease process – much like a transcription activator would. Hence the “transcription activator-like” part of the name. The central region of the TAL protein is made up of 17 to 18 repeats of the same 34 amino acid unit, with amino acids 12 and 13 of each unit determining what single DNA nucleotide it binds to. And unlike ZFNs, these units are pretty much completely modular and spell out an almost-unambiguous code for the targeted DNA sequence. Here’s the beautiful elegant table you’ve been waiting for:

Amino acids 12 & 13 DNA letter targeted
NI UNE
HD C
NN G or A
NK g
NG T

So with, say, 17 repeats = 17*34 = 578 amino acids plus the non-repeating C- and N-terminal sequences of a TAL, you can uniquely target a 17 base pair DNA sequence. Use two TALs and you can recognize 34 bases put FokI DNA-cleaving domains in between them, and you’ve got a TALEN.

The process for synthesizing TALENs – creating your custom amino acid sequence to bind the DNA sequence of interest, adding FokI, and so on – is not exactly trivial. For a 20-page protocol on how to make your own, see Sanjana 2012, and for some open source resources to help you design it, see Cornell University’s TALE-NT tools. Or you can buy a custom-designed one from Cellectis, which holds the exclusive commercial license on TALENs, for $5000.

TALENs are quite new at this point but have already been used in some cool applications. Ding 2013 reports on using them to make isogenic models of human disease – pairs of cell lines that are (theoretically) identical except for the single site of a disease-causing genetic mutation. (This is what we at Prion Alliance have proposed to do for FFI using ZFNs in our Rare Disease Challenge proposal). In practice, the cell lines didn’t turn out quite identical: the TALENs exhibited minimal off-target effects, but simply growing cells in culture leads to the gradual accumulation of mutations here and there (just as aging leads to gradual accumulation of somatic mutations in cells in your body).

Durai 2005, writing about ZFNs, says that making a double-stranded DNA break at an appropriate location can increase the efficiency of homologous recombination by 50,000-fold. But even with highly site-specific ZFNs or TALENs there is still no one ‘at the wheel’ making sure the ZFNs/TALENs and the new homologous DNA all end up at the right place at the right time and that DNA repair mechanisms stitch the chromosome back together in the way you want. So after you’ve used your ZFNs/TALENs you have to do sequencing to see what fraction of the cells got successful integration of the edits you were trying to make. In practice it will be some small-ish fraction of cells (say, anywhere from 1.6% to 34% in a recent report by Ding 2013) and so you’ll select those for your further experiments and cull the rest.

That’s one reason why these technologies are still a long ways from allowing us to perform gene therapy in every cell of an adult human. But in the immediate term, these will be amazing tools for research, letting us create new models of human diseases. In the slightly longer term, there is also the possibility that they’ll play a role in making it possible to transplant modified versions of your own cells back into your body, like they did in HIV. While that’s harder to do with brain than blood, Stem Cells Inc has already brought human neural stem cell transplants to the clinical development stage, so don’t rule it out.

update 2013-01-22: I just learned that the folks behind the Ding 2013 paper are sharing their plasmids through addgene.org as a public resource to help other researchers build their own TALENs. Impressionnant! Also another quick update: if you watched the Nature Biotechnology video on Youtube at the top of this post, you should be aware that this graphic at 1:24 is not really accurate:

The above graphic depicts the template for homology-directed repair (HDR) as being of the same length as the piece of DNA that was cut out of the original genome. In fact, HDR depends upon homologie between the new piece of DNA and the existing, uncut parts of the genome, so the introduced piece of DNA on top that you are trying to knock into the genome would need to extend beyond the points of the cut. So it should look something more like this:

Although, while qualitatively more correct, even this graphic does not depict properly the longueur of homology required for HDR. For ZFNs, apparently the new template DNA can be just

100b longer than the cut site on each side. That’s a big improvement over conventional knock-in without ZFNs/TALENs, which requires several kb of homology on each side of the desired mutation.

update 2013-01-22 #2: The question arose today as to whether TALENs, like ZFNs, could be designed to only function as heterodimers so as to reduce off-target effects. The answer is yes: Cade 2012 uses ‘obligate heterodimer’ TALENs in zebrafish and compares the results to homodimeric TALENs. Predictably, the ‘obligate heterodimer’ TALENs have fewer off-target effects.

update 2013-01-22 #3: We also had a discussion about costs for TALENs. As mentioned above, Cellectis sells custom-designed TALENs for $5000 a pair. Buying the requisite kit from addgene will run you just $300, plus several days of labor (assuming you know what you’re doing!) And although U.S. patent application EP2510096A2 looks to preclude anyone but Cellectis from selling TALENs commercially, research institutions do produce them internally as a service to research groups within the institution. I’m told that the ‘all-in’ price for getting TALEN-modified cell lines runs about $14,000. That includes design and assembly of TALENs, screening for cells that take up the TALEN plasmids, then screening for successfully modified cells and unmodified wild-type cells.

update 2013-06-07: Sigh – outdated no sooner than it was posted! Maintenant the hot new genome-editing technology is CRISPR, see e.g. Cong 2013. Also a colleague pointed out that the screenshot from that YouTube video above is inaccurate in another way – most of the time you don’t need to make deux double-stranded breaks, just one, in order to get homology-directed repair to kick in.

À propos d'Eric Vallabh Minikel

Eric Vallabh Minikel est dans une quête permanente pour prévenir la maladie à prions. Il est un scientifique basé au Broad Institute du MIT et à Harvard.


In vitro selection of zinc fingers with altered DNA-binding specificity

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Voir la vidéo: Régulation de lexpression des gènes (Mai 2022).


Commentaires:

  1. Grant

    Cool, je suis ému)

  2. Staerling

    Pour ma part, tu n'as pas raison. Je suis assuré. Je peux défendre la position. Écrivez-moi dans PM.

  3. Lad

    Et y a-t-il une autre option ?

  4. Gall

    Je ne peux pas participer maintenant à la discussion - c'est très occupé. Je serai libre - j'exprimerai nécessairement l'opinion.

  5. Ina

    Quelqu'un n'a pas pu le faire)))

  6. Dashakar

    On peut le découvrir?

  7. Fenriktilar

    Super, c'est un avis très précieux

  8. Mezigal

    Je m'excuse de vous avoir interrompu, mais pourriez-vous s'il vous plaît décrire un peu plus en détail.



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