Informations

6.1 : Le Réplicon - Biologie


Il est essentiel que tout l'ADN d'une cellule soit répliqué une et une seule fois par cycle cellulaire. Jacob, Brenner et Cuzin ont défini un réplicon comme l'unité dans laquelle la cellule contrôle les actes individuels de réplication. Ils ont proposé qu'un initiateur protéine interagit avec une séquence d'ADN, appelée réplicateur, pour démarrer la réplication. Le réplicateur peut être identifié génétiquement comme une séquence d'ADN requise pour la réplication, tandis que le origine est définie par des méthodes physiques ou biochimiques comme la séquence d'ADN à laquelle la réplication commence. Pour de nombreux réplicons, tels que le E. coli oriC et les séquences à réplication autonome (ou ARS) chez la levure, le réplicateur est aussi une origine. Cependant, ce n'est pas nécessairement le cas : le réplicon des gènes du chorion amplifiés chez les papillons à soie a une origine proche, mais séparable, du réplicateur. Des protéines initiatrices ont maintenant été identifiées pour certains réplicons, comme la protéine DnaA dans E. coli et le Complexe de reconnaissance d'origine dans la levure Saccharomyces cerevisiae. Dans les deux cas, ils se lient aux réplicateurs, qui sont également originaires de ces deux espèces.

Le réplicateur est une séquence d'ADN nécessaire à la synthèse du reste de l'ADN dans un réplicon. C'est un élément de contrôle qui affecte le chromosome sur lequel il se trouve. On dit que cet élément agit en cis, puisque le réplicateur et le réplicon sont sur le même chromosome. En revanche, l'initiateur est une protéine qui peut être codée sur n'importe quel chromosome d'une cellule. Ainsi agit-il dans trans, puisqu'il n'a pas à être codé sur le même chromosome que le réplicon qu'il contrôle. En général, un trans-le facteur agissant est une entité, généralement une protéine, qui peut diffuser à travers la cellule pour agir dans la régulation d'une certaine cible, alors qu'un cis-la séquence d'ADN agissant est sur le même chromosome que la cible du contrôle. Ce modèle d'un trans-protéine agissante se liant à un cis-le site agissant sur l'ADN est également observé dans le contrôle transcriptionnel.

Graphique 6.1. Composants d'un réplicon, l'unité dans laquelle la cellule contrôle la réplication.

Exercer

Même si E. coli a une seule origine dans un seul réplicon, les chromosomes eucaryotes ont plusieurs origines et plusieurs réplicons. Considérons une lignée de cellules de mammifères en culture qui a une phase S de 5 heures, c'est-à-dire que tout le génome est répliqué en 5 heures. La taille du génome haploïde est de 3 x 109 pb. Si le taux de mouvement de la fourche de réplication dans ces lignées cellulaires est de 2000 pb par min, combien de réplication origines sont nécessaires pour reproduire l'ensemble haploïde génome pendant la phase S ? Supposons que deux fourches de réplication émergent de chaque origine (il s'agit d'une réplication bidirectionnelle, voir ci-dessous).

Approches expérimentales pour cartographier les origines et les terminaisons de la réplication et pour distinguer la réplication unidirectionnelle et bidirectionnelle

Plusieurs techniques expérimentales ont été établies pour trouver où la réplication commence et se termine sur les chromosomes, et pour faire la distinction entre la réplication unidirectionnelle et bidirectionnelle. Nous aborderons deux techniques principales.


CONTIGuator : un outil de finition des génomes bactériens pour des informations structurelles sur les ébauches de génomes

Les développements récents des technologies de séquençage ont permis de séquencer de nombreux génomes bactériens avec un coût et une main-d'œuvre limités, par rapport aux techniques précédentes. Cependant, une étape limitante du séquençage du génome est le processus de finition, nécessaire pour déduire la position relative de chaque contig et combler les lacunes de séquençage. Un degré supplémentaire de complexité est donné par les espèces bactériennes hébergeant plus d'un réplicon, qui ne sont pas envisagées par les programmes actuellement disponibles. La disponibilité d'un grand nombre de génomes bactériens permet aux généticiens d'utiliser des génomes complets (éventuellement de la même espèce) comme modèles pour la cartographie des contigs.

Nous présentons ici CONTIGuator, un outil logiciel de cartographie de contigs sur un génome de référence qui permet de visualiser une carte de contigs, soulignant la perte et/ou le gain d'éléments génétiques et permettant de finir des génomes multipartites. La fonctionnalité de CONTIGuator a été testée à l'aide de quatre génomes, démontrant ses performances améliorées par rapport aux programmes actuellement disponibles.

Notre approche semble efficace, avec une visualisation claire, permettant à l'utilisateur d'effectuer une analyse comparative de génomique structurale sur des ébauches de génomes. CONTIGuator est un script Python pour les environnements Linux et peut être utilisé sur des ordinateurs de bureau normaux et peut être téléchargé à partir de http://contiguator.sourceforge.net.


Rapport de projet sur la réplication de l'ADN

Un rapport de projet exclusif sur la réplication de l'ADN. Ce rapport de projet vous aidera à en savoir plus sur : 1. Introduction à la réplication de l'ADN 2. Preuves de la méthode semi-conservatrice de réplication 3. Mécanisme de réplication de l'ADN 4. Réplication de l'ADN bactérien.

Rapport de projet n°1. Introduction à la réplication de l'ADN :

C'est le processus par lequel une cellule copie son ADN. La réplication est nécessaire pour que les informations génétiques présentes dans les cellules puissent être transmises aux cellules filles après la division cellulaire. Delbruck a suggéré que les modèles d'ADN Watson-Crick pourraient théoriquement se répliquer selon trois modes : conservateur, semi-conservateur et dispersif (Fig. 4.10).

je. D'après le mode conservateur formé les deux doubles hélices, l'une serait entièrement en matière ancienne et l'autre entièrement en matière neuve.

ii. Selon le mode semi-conservateur, chaque brin des deux doubles hélices formées aurait un ancien et un nouveau brin.

iii. Selon le mode de réplication dispersif,. La double hélice d'ADN se briserait en plusieurs points formant de nombreux morceaux. Chaque pièce se reproduirait, puis les pièces se recon­nectaient au hasard. Ainsi les deux doubles hélices formées auraient un patchwork de pièces anciennes et nouvelles.

Cependant, comme il est démontré que le mode de réplication semi-conservateur est le modèle général de réplication, cette méthode a été discutée ci-dessous.

Le modèle à double hélice d'ADN tel que préparé par Watson et Crick est doté de la propriété de réplication. Les deux brins de la double hélice qui est maintenu ensemble par collage entre les deux bases A-T, G-C, se déroulent et se séparent en deux brins simples. Les deux brins d'hélice sont enroulés de manière anti-parallèle l'un par rapport à l'autre.

Avec le début du déroulement, la synthèse de nouveaux brins ou la duplication commence à l'aide de l'enzyme ADN polymérase, découverte par Kornberg (Fig. 4.11).

Comme les deux brins sont complémentaires, les bases complémentaires sont attachées dans les brins sœurs contre celle parentale (Fig. 4.12). Des deux brins de la double hélice nouvellement synthétisée, l'un est parental et l'autre est le nouvellement synthétisé. En tant que telle, la réplication est qualifiée de semi-conservatrice.

Si un seul brin est disponible, on peut produire la composition du brin sœur sur la base de la complémentarité. Le brin parental sert de moule ou de modèle pour la synthèse de nouveaux brins.

Pour la réplication combinée, le même processus est répété où les deux brins de la double hélice servent de matrice pour la synthèse de nouvelles doubles hélices. L'ensemble du processus est comparable à la production d'un tirage à partir d'un négatif en photographie, où les zones les plus sombres d'un négatif apparaissent comme des zones plus claires en positif.

La différence fondamentale entre le traitement photographique et la réplication de l'ADN est que, dans la photographie, le négatif reste sous forme négative et d'innombrables tirages peuvent être tirés du même négatif, et les tirages ne peuvent pas servir de négatif comme dans la réplication de brins d'ADN.

Dans la réplication de l'ADN, bien que les deux brins de la double hélice nouvellement synthétisée qui contiennent théoriquement un négatif et un positif, puissent tous deux servir de négatif dans le prochain cycle de réplication.

Rapport de projet n° 2. Preuves de la méthode semi-conservatrice de réplication:

Il existe suffisamment de preuves pour prouver que l'ADN double brin se réplique par une méthode semi-consertive et prudente.

Expérience de Meselson et Stahl’ :

Meselson et Stahl en 1958 ont rapporté les résultats d'une expérience qui a été conçue pour tester si l'ADN double brin se réplique d'une manière semi-conservatrice.

Les deux principes de base suivants ont été impliqués :

(i) L'ADN a été marqué avec de l'azote lourd (N 15 ) et a ensuite été laissé se répliquer dans un milieu contenant du N 15 . Si la réplication est semi-conservatrice, alors après la première génération de réplication, l'un des deux brins aurait de l'azote normal (N 14 ).

La molécule résultante aurait une densité intermédiaire entre l'ADN N 14 et. Cette densité diminuera progressivement dans la réplication des cycles suivants et se rapprocherait de celle de l'ADN N14.

(ii) Un autre principe utilisé était la préparation du gradient de densité de chlorure de césium. Ce gradient de densité est préparé par dilution progressive d'une solution de sel lourd. Lorsque celle-ci est soumise à une ultracentrifugation avec une substance ayant une densité dans la gamme de ce gradient, cette substance trouvera place à son propre niveau de densité. Cela permet de détecter de très légères différences de densité.

Meselson et Stahl ont permis aux cellules d'Escherichia coli de croître sur un milieu de culture N 15 pendant environ 14 générations de cellules, de sorte que presque tout l'azote (N 14 ) dans l'ADN est remplacé par N 14 . Ensuite, les cellules ont été brutalement transférées dans du milieu de culture N14.

Etant donné que le temps requis pour une génération de cellules a été déterminé à environ 30 minutes, il a été possible d'éliminer les cellules après un ou plusieurs nombres connus de générations de réplication. Leur ADN a ensuite pu être analysé et les résultats suivants ont été obtenus.

L'échantillon d'ADN obtenu une génération de cellules après le transfert dans un milieu de culture N 14 n'a montré qu'une seule bande de densité telle qu'observée à travers le schéma d'absorption ultra-violet. Cette bande indiquait une densité homogène uniforme d'ADN après une génération cellulaire.

La bande était exactement entre les bandes formées par l'ADN N 14 et l'ADN N 15, indiquant que tout l'ADN trouvé après la première génération a une densité intermédiaire (Fig. 4.13). C'est ce à quoi on s'attendrait si l'ADN se réplique de manière semi-conservatrice.

Après deux générations, lorsque l'ADN a été analysé, deux bandes ont été observées, comme on pourrait s'y attendre selon la méthode semi-conservatrice de réplication. Ces deux bandes étaient d'intensité égale après la deuxième génération. Dans les générations suivantes, bien que les deux mêmes bandes soient apparues, l'intensité de la bande de densité hybride a progressivement diminué, tandis que l'intensité de la bande de densité lumineuse a progressivement augmenté.

L'expérience de Meselson et Stahl est donc une expérience classique qui a été la première à montrer que l'ADN se réplique de manière semi-conservatrice (Fig 4.14).

Dans une expérience sur Vicia faba, menée par Taylor et al. (1957), les cellules végétales ont d'abord été cultivées dans un milieu contenant de la thymidine radioactive, puis transférées dans un milieu normal. Les noyaux de la phase S incorporaient de la thymidine dans l'ADN tandis que ceux qui avaient terminé la réplication de l'ADN n'étaient pas marqués. Après arrêt métaphasique avec la colchicine, dans le X1 division, les deux chromatides semblaient marquées, comme étudié par autoradiographie. Dans la prochaine génération de cellules X1, dans un milieu de croissance normal, un brin de chaque chromosome était marqué alors que l'autre ne l'était pas.

Il a été conclu qu'avant la réplication, chaque chromosome se comporte comme s'il avait deux unités d'ADN sur sa longueur. Au cours de la phase S, deux nouvelles unités marquées sont construites le long des fils d'ADN d'origine selon une méthode semi-conservatrice. Ainsi chaque chromatide comprend un brin original non marqué et un nouveau brin marqué qui lui est complémentaire.

Dans la deuxième phase S, puisque le milieu ne contient pas d'isotopes, les brins marqués et non marqués se séparent en chromatides sœurs marquées et non marquées (Fig. 4.15).

Rapport de projet n° 3. Mécanisme de réplication de l'ADN:

Le mécanisme de réplication de l'ADN est très similaire dans la plupart des organismes. Des différences n'existent qu'en ce qui concerne les enzymes et les protéines impliquées (tableau 4.3). Chez les procaryotes tels que E. coli, les enzymes, les ADN polymérases I et III, sont responsables de la synthèse de l'ADN, tandis que l'ADN polymérase II est impliquée dans la réparation de la réplication.

Chez les eucaryotes, l'ADN est répliqué par différentes ADN polymérases (α, β, , , , , etc.). La réplication doit être très précise car même une petite erreur entraînerait la perte d'informations génétiques importantes après seulement quelques divisions cellulaires.

La précision est assurée par la capacité des ADN polymérases à vérifier que les bonnes bases ont été insérées dans le brin nouvellement synthétisé. Ceci est réalisé grâce à l'activité exonucléase inverse (3′ > 5′) des enzymes qui leur permet d'éliminer les bases incorrectement insérées de l'ADN nouvellement synthétisé et de les remplacer par la base correcte. C'est ce qu'on appelle la capacité de preuve et de lecture.

Au cours de la réplication de l'ADN, la double hélice d'ADN entière est progressivement déroulée, produisant des segments d'ADN simple brin qui peuvent être copiés par des polymères d'ADN. Le déroulement de la double hélice commence à une position distincte appelée origine de réplication et progresse progressivement le long de la molécule, généralement dans les deux sens (bidirectionnel) ou peut être unidirectionnel (Fig. 4.16A).

En mode unidirectionnel, une fourche de réplication quitte l'origine et se déplace le long de l'ADN, tandis qu'en mode bidirectionnel, deux fourches de réplication se forment et se déplacent loin de l'origine dans des directions opposées (Fig. 4.16B).

Les origines de réplication contiennent généralement des séquences riches en paires de bases A-T faibles. La région où l'hélice se déroule et le nouvel ADN est synthétisé s'appelle la fourche de réplication. Au niveau de la fourche de réplication, un certain nombre d'événements distincts se produisent sous l'influence de différentes enzymes et protéines (Fig. 4.17) :

(i) Séparation de la double hélice :

Ceci est obtenu par l'action d'une enzyme hélicase. Après la séparation des brins, la protéine de liaison simple brin (SSB) se fixe à l'ADN et empêche la double hélice de se reformer.

(ii) Synthèse des brins en avance et en retard :

La synthèse de l'ADN par les ADN polymérases ne se produit que dans le sens 5′ → 3′. Comme les deux brins de la double hélice fonctionnent dans des directions opposées (un brin va 5′ → 3′ et l'autre 3′ → 5′), des mécanismes légèrement différents sont nécessaires pour se répliquer chacun. Un brin, appelé brin d'attaque, est copié dans le même sens que l'hélice de déroulement et peut donc être synthétisé en continu (Fig. 4.18A).

L'autre brin, dit brin retardé, est synthétisé en sens inverse et doit être copié de manière discontinue. Le brin retardé est synthétisé sous la forme d'une série de segments appelés fragments d'Okazaki (Fig. 4.18A).

Les ADN polymérases nécessitent une courte région double brin pour initier ou amorcer la synthèse d'ADN. Celui-ci est produit par une ARN polymérase, appelée primase, qui est capable d'initier la synthèse sur l'ADN simple brin. La primase synthétise une courte séquence d'amorce d'ARN sur la matrice d'ADN créant une courte région double brin.

Dans E. coli, l'ADN poly­merase III synthétise ensuite l'ADN en commençant par l'amorce d'ARN. Sur le brin retardé, la synthèse se termine lorsque la prochaine amorce d'ARN est rencontrée. À ce stade, l'ADN polymérase I prend le relais et supprime l'amorce d'ARN en la remplaçant par l'ADN (Fig. 4.18B). Chez les eucaryotes, la situation est différente.

L'ADN polymérase qui a une activité primase intégrale est responsable de l'initiation de la synthèse d'ADN. L'ADN est répliqué par les ADN polymérases et δ avec un synthétisant le brin retardé et synthétisant le brin leader. Les autres polymérases ont des rôles auxiliaires. L'ADN polymérase e est impliquée dans la réparation de l'ADN et l'ADN polymérase réplique l'ADN mitochondrial.

L'étape finale requise pour achever la synthèse du brin retardé consiste à réunir les fragments d'Okazaki par des liaisons phosphodiester. Ceci est réalisé par une enzyme ADN ligase (Fig. 4.18B).

Rapport de projet n° 4. Réplication de l'ADN bactérien :

Bien que le mécanisme de réplication de l'ADN soit similaire dans tous les organismes, le processus global varie en fonction de la nature de la molécule d'ADN copiée. Différentes stratégies sont nécessaires pour la réplication des molécules d'ADN circulaires qui se produisent dans les bactéries et pour les molécules d'ADN chromosomiques linéaires présentes chez les eucaryotes.

La forme de réplication la plus simple et la plus courante pour l'ADN circulaire implique une seule origine de réplication à partir de laquelle deux fourches de réplication progressent dans des directions opposées. Il en résulte une forme intermédiaire (Fig. 4.19). Les fourches de réplication se rencontrent et fusionnent régulièrement, et la réplication se termine.

La réplication des molécules d'ADN nécessite le déroulement de la double hélice d'ADN. Cela provoque la rotation de l'hélice devant la fourche de réplication. Pour les molécules d'ADN circulaires qui n'ont pas d'extrémités libres, cela produit un superenroulement de l'ADN qui empêche la fourche de réplication de progresser.

Ce problème est surmonté par l'action d'enzymes appelées gyrases ou topoisomérases. L'ADN topoisomérase I produit une rupture transitoire dans le squelette polynucléotidique de l'un des brins d'ADN, une courte distance en avant de la fourche de réplication, permettant à l'ADN de tourner librement autour de l'autre brin intact en supprimant le superenroulement.

L'enzyme rejoint ensuite les extrémités du brin cassé. Lorsque la réplication d'un chromosome bactérien est terminée, deux molécules filles circulaires imbriquées sont produites.

Celles-ci sont séparées par l'action de l'ADN topoi­somerase II qui agit en provoquant des cassures transitoires dans les deux brins de l'une des molécules d'ADN laissant passer l'autre molécule d'ADN, séparant ainsi les deux molécules filles. L'enzyme topoisomérase II rejoint alors les brins rompus.

Réplication de l'ADN chez les eucaryotes :

En raison de la longueur extrême des chromosomes eucaryotes, la réplication de l'ADN doit être initiée à des origines multiples pour garantir que le processus est terminé dans un laps de temps raisonnable. Les fourches de réplication procèdent dans les deux sens à partir de chaque origine de réplication, formant des bulles de réplication, qui se rencontrent et fusionnent régulièrement.

L'ADN répliqué à partir d'une origine unique s'appelle un réplicon. Tout l'ADN n'est pas répliqué en même temps. Des grappes d'environ 50 réplicons s'amorcent simultanément à des points définis pendant la phase S. Les zones contenant des gènes transgéniquement actifs sont répliquées en premier, les régions non actives étant répliquées plus tard.

L'ADN des chromosomes eucaryotes est conditionné sous forme de complexes ADN-protéine appelés nucléosomes. Au fur et à mesure que la fourche de réplication progresse, l'ADN doit se dérouler du nucléosome pour que la réplication se produise. Cela ralentit la progression des fourches de réplication et peut expliquer la courte longueur des fragments d'Okazaki sur le brin retardé chez les eucaryotes (100-200 bases) par rapport aux procaryotes (1000-2000 bases).

Une fois la fourche de réplication passée, les nucléosomes se reforment. La réplication des chromosomes eucaryotes linéaires pose un problème que l'on ne rencontre pas avec les chromosomes bactériens circulaires.L'extrémité 5 & 8242 extrême du brin retardé dans l'ADN linéaire ne peut pas être répliquée car il n'y a pas de place pour qu'une amorce d'ARN initie la réplication.

Cela crée un potentiel de raccourcissement des chromosomes après chaque cycle de réplication, entraînant une perte d'informations génétiques.

Le problème est surmonté par une structure spécialisée à l'extrémité du chromosome connue sous le nom de télomère qui contient des répétitions en tandem d'une simple séquence non codante. De plus, l'extrémité 3 & 8242 du brin avant s'étend au-delà de l'extrémité 5 & 8242 du brin retard.

L'enzyme télomérase contient une molécule d'ARN qui chevauche partiellement et se lie à la séquence répétée sur le brin principal. L'enzyme étend ensuite le brin principal en utilisant l'ARN comme matrice.

La télomérase se dissocie alors et se lie à la nouvelle extrémité des télomères, de sorte que le brin de tête s'allonge à nouveau. Ce processus d'extension peut se produire des centaines de fois avant que la télomérase ne se dissocie finalement. Le brin avant nouvellement étendu agit alors comme un modèle pour la réplication de l'extrémité 5 & 8242 du brin retardé (Fig. 4.20).

Les deux processus par lesquels l'ADN est raccourci pendant la réplication normale et allongé par l'action de la télomérase sont à peu près équilibrés de sorte que la longueur totale du chromosome reste approximativement la même.


Introduction

Le virus de l'hépatite C (VHC) est un virus enveloppé à ARN simple brin de sens positif de la famille des flaviviridae ( Lindenbach et Rice, 2001 ). Le génome d'environ 9,6 kb est traduit en une seule polyprotéine qui est ensuite transformée en au moins 10 protéines structurelles et non structurelles qui sont nécessaires à la réplication de l'ARN viral et à l'assemblage de nouveaux virions ( Lindenbach et Rice, 2001 ). Historiquement, l'étude du cycle de vie du VHC a été difficile, étant donné l'incapacité du VHC à se répliquer in vitro dans des cellules de culture tissulaire ( Lindenbach et Rice, 2005 ). Cependant, le développement de réplicons complets et subgénomiques, qui expriment des protéines du VHC suffisantes pour la réplication de l'ARN viral dans les cellules d'hépatome (Huh-7), a grandement amélioré notre compréhension de la biologie du VHC et des interactions virus-hôte ( Lohmann et al, 1999 Fléau et al, 2000 ).

Une interaction virus-hôte critique requise pour la réplication du VHC est le complexe associé à la membrane composé de protéines virales et hôtes et de membranes cellulaires altérées, appelé le réseau membranaire ( Egger et al, 2002 Gosert et al, 2003 ). Cette association avec les membranes de l'hôte s'est avérée être une stratégie utile pour le VHC car les membranes peuvent servir d'objet fixe à partir duquel les protéines virales peuvent être attachées. FBL2 a été identifié comme une protéine hôte géranylgéranylée de 50 kDa qui est nécessaire pour la localisation du complexe de réplication du VHC grâce à son association étroite avec la protéine du VHC NS5A et est critique pour la réplication du VHC ( Wang et al, 2005 ). L'étendue de la géranylgéranylation de FBL2 est connue pour avoir un impact sur la réplication du VHC. Par exemple, l'inhibition de la protéine géranylgéranyl transférase I (PGGT), une enzyme qui transfère le géranylgéranyl pyrophosphate (GGPP) aux protéines cellulaires à des fins d'ancrage membranaire, a un impact négatif sur la réplication du VHC ( Ye et al, 2003 ). À l'inverse, les agents chimiques qui augmentent les concentrations de GGPP intracellulaire favorisent la réplication virale ( Kapadia et Chisari, 2005 ). Compte tenu de l'importance des membranes de l'hôte pour la réplication du VHC, il n'est pas surprenant que les métabolites de ces voies aient un impact sur la réplication de l'ARN du VHC.

Cette interaction entre le VHC et les membranes de l'hôte constitue la base des thérapies candidates actuelles pour le traitement des infections par le VHC à l'aide de statines. La composition de la membrane cellulaire hôte peut être directement modifiée par les produits de la voie des stérols, qui est vitale pour la synthèse du cholestérol et des intermédiaires isoprénoïdes, et la voie de biosynthèse des acides gras (Goldstein et Brown, 1990). Il a été démontré que l'inhibition chimique des enzymes dans l'une ou l'autre de ces voies a un impact sur la réplication virale, à la fois positivement et négativement (Su et al, 2002 Oui et al, 2003 Kapadia et Chisari, 2005 Sagan et al, 2006 Amemiya et al, 2008 ). Par exemple, les composés de statine inhibent la 3-hydroxy-3-méthylglutaryl coenzyme A réductase (HMGCR), l'enzyme limitant la vitesse de la voie des stérols (Goldstein et Brown, 1990), et il a été suggéré qu'ils inhibent la réplication du VHC en réduisant finalement le pool de GGPP ( Oui et al, 2003 Kapadia et Chisari, 2005 Ikeda et al, 2006 ).

Cependant, les doses cliniques de statines actuellement utilisées pour traiter l'hypercholestérolémie ne sont pas suffisamment élevées pour inhiber la synthèse des lipides de géranyl. L'utilisation de statines pour le traitement du VHC est susceptible d'être encore compliquée par l'augmentation compensatoire signalée de l'expression de HMGCR in vitro et in vivo ( Calcul et al, 1989 Cohen et al, 1993 ) en réponse au traitement. La découverte récente que la réplication de l'ARN du VHC augmente avec le traitement à la fluvastatine chez les patients co-infectés VIH/VHC ( Milazzo et al, 2009 ) est compatible avec une augmentation de l'expression de HMGCR. Les enzymes de la voie des stérols sont régulées au niveau transcriptionnel par les protéines de liaison aux éléments régulateurs des stérols (SREBP), en particulier SREBP-2, qui est un facteur de transcription lié à la membrane du RE (Hua et al, 1993 Brown et Goldstein, 1997 ). Lorsque les réserves de cholestérol dans les cellules sont épuisées, SREBP-2 est escortée du RE jusqu'au complexe de Golgi par la protéine d'activation du clivage SREBP, une protéine d'escorte détectant les stérols ( Hua et al, 1996 Brown et Goldstein, 1999 ). SREBP-2 est ensuite clivé par les protéases localisées dans le Golgi S1P et S2P, libérant ainsi le domaine basique hélice-boucle-hélice N-terminal, qui migre vers le noyau et active la transcription des gènes dans la voie des stérols qui contiennent des éléments de réponse aux stérols dans leurs exhausteurs ( Smith et al, 1988 , 1990 Sakaï et al, 1996 Brown et Goldstein, 1999 ). Les gènes cibles bien caractérisés comprennent HMGCR, HMG-CoA synthase, farnésyl pyrophosphate (FPP) synthase, squalène synthase (SQLS) et le récepteur LDL (Horton et al, 2002 ). L'exigence de métabolites supplémentaires de la voie des stérols en aval pour la réplication du VHC n'a pas été complètement élucidée.

La génétique chimique est un moyen efficace de déterminer les mécanismes médicamenteux ( Stockwell, 2004 ) où, sous la forme la plus simple, des perturbations chimiques uniques peuvent élucider les composants d'un système qui sont essentiels pour un phénotype donné. Cependant, les connexions fonctionnelles entre les composants du système sont mieux identifiées soit par des données d'interaction directe, soit par la mesure des effets de combinaison ( Boone et al, 2007 ). Une approche qui a été couronnée de succès est l'utilisation de perturbagènes chimiques appliqués en combinaison ( Lehár et al, 2007 , 2008 ). Pour de telles études de génétique chimique combinées, l'interaction doit être comparée aux effets individuels d'un agent unique pour déterminer s'il existe une « synergie », où les agents coopèrent vers un phénotype, ou « l'antagonisme », où ils entravent l'activité de l'autre ( Greco et al, 1995 ). Ainsi, l'accent mécaniste peut être déplacé des cibles individuelles vers les interactions entre elles.

Ici, nous présentons un criblage génétique chimique entrepris pour mieux comprendre l'impact de la voie des stérols et de sa régulation sur la réplication du réplicon du VHC à l'aide d'une combinaison de plate-forme de criblage à haut débit (cHTS) (Borisy et al, 2003 ). En utilisant cette approche, nous avons identifié plusieurs cibles antivirales efficaces, y compris SREBP-2 ainsi que des cibles en aval de HMGCR dans la voie des stérols telles que l'oxydosqualène cyclase (OSC) ou la lanostérol déméthylase. Il est à noter que les combinaisons entre les sondes ciblant les enzymes en aval de l'OSC ont produit de solides synergies entre elles ou avec un inhibiteur de PGGT. De plus, nos données suggèrent que l'inhibition de la voie des stérols sans inhibition des mécanismes de rétroaction régulatrice entraîne finalement une augmentation de la réplication du réplicon. Par conséquent, les combinaisons d'inhibiteurs de cibles en amont de l'OSC sont apparues antagonistes avec des effets épistatiques dominants par rapport aux inhibiteurs de cibles en aval.


Affiliations

Département de biologie, Université de Bergen, Thor Møhlens gate 55, Bergen, 5020, Norvège

Marius Karlsen & Are Nylund

Intervet Norbio, Thor Møhlens gate 55, Bergen, 5008, Norvège

École norvégienne des sciences vétérinaires, Thor Møhlens gate 55, Oslo, Norvège

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Auteur correspondant


Résumé

Les systèmes biologiques fonctionnent grâce à des interactions dynamiques entre les gènes et leurs produits, des circuits de régulation et des réseaux métaboliques. Notre développement du logiciel Pathway Tools a été motivé par le besoin de construire des ressources de connaissances biologiques qui combinent ces nombreux types de données, et qui permettent aux utilisateurs de trouver et de comprendre les données d'intérêt le plus rapidement possible grâce à des outils de requête et de visualisation. En outre, nous avons cherché à soutenir le développement de modèles de flux métaboliques à partir de bases de données de voies et à utiliser les informations sur les voies pour tirer parti de l'interprétation d'ensembles de données à haut débit.

Au cours des 4 dernières années, nous avons amélioré le logiciel Pathway Tools déjà très complet à plusieurs égards. Il peut désormais prendre en charge l'exécution de modèles métaboliques via le Web, il fournit un remplissage plus précis pour les modèles métaboliques, il prend en charge le développement de modèles pour les communautés d'organismes répartis sur une grille spatiale et les résultats du modèle peuvent être visualisés graphiquement. Pathway Tools prend en charge plusieurs nouveaux outils d'analyse de données omiques, notamment le tableau de bord Omics, des diagrammes multi-voies appelés collages de voies, un algorithme couvrant les voies pour l'analyse des données métabolomiques et un algorithme pour générer des explications mécanistes des données multi-omiques. Nous avons également amélioré les capacités de gestion des bases de données de voies/génomes de base du logiciel, en fournissant de nouveaux outils de recherche multi-organismes pour les communautés d'organismes, un rendu graphique amélioré, des performances plus rapides et des pages de gènes et de métabolites repensées.


II PROGRÈS DANS LE DÉVELOPPEMENT DE LA THÉRAPIE CELLULAIRE AUTOLOGUE BASÉE SUR L'IPSC

Depuis la première greffe inhumaine de cellules autologues dérivées d'iPSC en 2014, les efforts récents visant à traduire les thérapies autologues à base d'iPSC en clinique se sont intensifiés (Fig. 1). Cette section et le tableau 1 fournissent un échantillon des thérapies cellulaires autologues basées sur les iPSC actuellement en développement et ne constituent pas une liste exhaustive (tableau 1).

Organe Indication Produit cellulaire Reprogrammation du matériel de départ et de la technique choisie Organiser Enquêteur, établissement Pays
Œil Dégénérescence maculaire sèche liée à l'âge Feuille de cellules épithéliales pigmentaires rétiniennes sur échafaudage PLGA Cellules CD34+, plasmides épisomiques Phase I/IIa Kapil Bharti, NIH/NEI Etats-Unis
Œil Dégénérescence maculaire humide liée à l'âge Feuille de cellules épithéliales pigmentaires rétiniennes Fibroblastes, plasmides épisomiques 1 patient dosé (2014) Masayo Takahashi, RIKEN Japon
Cerveau la maladie de Parkinson Cellules progénitrices dopaminergiques Fibroblastes, plasmides épisomiques 1 patient dosé (2018) Kwang-Soo Kim, Hôpital McLean/École de médecine de Harvard Etats-Unis
Cerveau la maladie de Parkinson Neurones dopaminergiques Fibroblastes, technique choisie non précisée dans la publication Préparation à l'IND Jeanne Loring, Neurosciences d'Aspen Etats-Unis
Cerveau la maladie de Parkinson Neurones dopaminergiques Technique choisie pour les études chez l'homme non spécifiée dans la publication Publication d'études sur des primates non humains, préparant l'IND Ole Isacson et Penny Hallett, Institut de recherche en neurorégénération à l'hôpital McLean/Harvard Medical School Etats-Unis
Du sang Thrombocytopénie Plaquettes Cellules mononucléées du sang périphérique, plasmides épisomiques 1 patient a reçu plusieurs doses (2019-2020) Koji Eto, Université de Kyoto Japon
Peau Épidermolyse bulleuse dystrophique récessive Kératinocytes et fibroblastes modifiés génétiquement Fibroblastes, ARN Etudes souris en cours, préparation à l'IND Dennis Roop, Gates Center for Regenerative Medicine Ganna Bilousova et Igor Kogut, University of Colorado School of Medicine Etats-Unis
Peau Épidermolyse bulleuse dystrophique récessive Kératinocytes et fibroblastes modifiés génétiquement Fibroblastes, plasmides épisomiques Études sur la souris publiées, préparant l'IND Angela Christiano, Université de Columbia Etats-Unis
Peau Épidermolyse bulleuse dystrophique récessive Kératinocytes et fibroblastes modifiés génétiquement Fibroblastes et kératinocytes, approche lentivirale excisable pour la reprogrammation, approche AAV excisable pour l'édition de gènes Études sur la souris publiées, préparant l'IND Anthony Oro, Université de Stanford Etats-Unis
Peau Perte de cheveux Papilles dermiques dérivées de la crête neurale Cellules mononucléées du sang périphérique, virus de Sendai Études sur la souris publiées, préparant l'IND Alexey Terskikh, Sanford Burnham Prebys Medical Discovery Institute/Stemson Therapeutics Etats-Unis
Muscle Dystrophies musculaires Cellules souches myogéniques Cellules mononucléées du sang périphérique A reçu la désignation de médicament orphelin de la FDA, se préparant à l'IND Douglas Falk, Vita Therapeutics Etats-Unis
Œil Troubles dégénératifs de la rétine (par exemple, rétinite pigmentaire) Précurseurs des photorécepteurs Fibroblastes, virus Sendai Études sur la souris publiées Budd Tucker, Université de l'Iowa Etats-Unis
  • une Le tableau 1 comprend un échantillon des thérapies cellulaires autologues à base d'iPSC en cours de développement. Les matériaux de départ de reprogrammation et les techniques de reprogrammation choisies illustrés ici sont basés sur les publications disponibles et peuvent changer à mesure que les programmes avancent vers la clinique.

A Indications pour les greffes de cellules autologues dérivées d'iPSC chez l'humain

I Cellules épithéliales pigmentaires rétiniennes dérivées d'iPSC pour la dégénérescence maculaire liée à l'âge

Les cellules épithéliales pigmentaires rétiniennes (RPE) dérivées d'iPSC ont été le premier type de cellule autologue dérivé d'iPSC à être transplanté chez un humain, réalisé en 2014 par l'équipe de Masayo Takahashi au RIKEN Center for Developmental Biology au Japon (Mandai et al., 2017 Schweitzer et al., 2020). Cette greffe a été réalisée pour traiter la dégénérescence maculaire liée à l'âge (DMLA), une maladie chronique caractérisée par la dégénérescence des cellules RPE et la principale cause de perte de vision chez les personnes de plus de 60 ans (Sharma, Bose, Maminishkis, & Bharti, 2020). Il y a trois raisons principales pour lesquelles les RPE ont été la première greffe dérivée des iPSC : (1) l'œil est relativement facile à imager et à accéder chirurgicalement (2) les RPE ont été le premier type de cellule oculaire à être différencié des iPSC, en 2009, il y a seulement 2 ans après la publication historique démontrant la génération d'iPSC (Buchholz et al., 2009) et (3) des expériences chirurgicales précédentes avaient montré une preuve de concept soutenant une thérapie cellulaire autologue pour la DMLA. Dans ces expériences, des RPE de la région saine d'un œil d'un patient atteint de DMLA ont été prélevés et transplantés dans la région dégénérée du même œil (Van Meurs et al., 2004 Van Zeeburg, Maaijwee, Missotten, Heimann, & Van Meurs, 2012 ). Il s'agissait de chirurgies complexes nécessitant une habileté et une précision importantes qui ont finalement abouti à la récupération partielle de la vision.

Dans leur étude révolutionnaire, l'équipe de Takahashi a transplanté une feuille iPSC-RPE mesurant 1,3 × 3 mm sous la fovéa de l'œil droit d'une patiente de 77 ans atteinte de DMLA néovasculaire (« humide ») (Mandai et al., 2017 ) . Les iPSC ont été reprogrammées à partir de fibroblastes à l'aide de vecteurs épisomiques non intégrateurs, différenciées en RPE avec un processus de 6 semaines en utilisant une combinaison de méthodes de différenciation dirigée et spontanée, puis purifiées et étendues sur une période de 6 semaines (Kamao et al., 2014 Mandai et al., 2017 Osakada, Ikeda, Sasai et Takahashi, 2009 Osakada et al., 2009 ). Sur une période de 8 semaines, des colonies RPE sélectionnées ont été ensemencées sur un transwell revêtu de collagène pour former la feuille RPE, qui a été retirée du transwell par traitement avec du collagène IV. De la collecte des tissus cutanés à l'expédition des feuilles de cellules RPE, le processus a pris environ 10 mois (Mandai et al., 2017). Un suivi de 4 ans a démontré que la feuille RPE dérivée de l'iPSC avait survécu et présentait une morphologie normale (Takagi et al., 2019). Le patient n'a connu aucun événement indésirable grave, démontrant un profil d'innocuité prometteur pour les greffes iPSC-RPE. Bien qu'il n'y ait eu aucune amélioration de la vision, la vision du patient est restée stable depuis la chirurgie, malgré une diminution continue au cours des années précédant la chirurgie.

Les efforts pour apporter une thérapie cellulaire iPSC-RPE autologue aux patients ont été poursuivis par l'équipe de Kapil Bharti au National Eye Institute du NIH. L'équipe de Bharti a développé des patchs RPE dérivés d'iPSC de qualité clinique sur un échafaudage biodégradable à base d'acide poly-(lactique-co-glycolique) (PLGA). L'échafaudage PLGA, unique à l'approche de Bharti, sert à plusieurs fins, notamment en permettant aux RPE de former une monocouche confluente et correctement polarisée et en fournissant une intégrité structurelle pour une transplantation plus facile. Les patchs ont été transplantés avec succès dans des modèles de rats du Royal College of Surgeons (RCS) et de porcs blessés par RPE induits par laser (Sharma et al., 2019). Les iPSC ont été générés à partir de cellules CD34+ isolées du sang périphérique des patients à l'aide d'un protocole de reprogrammation épisomique de qualité clinique (Mack, Kroboth, Rajesh et Wang, 2011). Ils ont ensuite été différenciés en RPE matures via un protocole de différenciation dirigée monocouche triphasique de 11 semaines. Les progéniteurs RPE ont été enrichis et ensemencés sur un échafaudage PLGA pour mûrir pendant les 35 derniers jours. L'imagerie 10 semaines après la transplantation a confirmé que l'échafaudage PLGA s'était efficacement dégradé. Le patch iPSC-RPE s'est intégré à la fois dans les modèles de rat et de porc, démontrant même sa fonctionnalité en phagocytant les segments de tige externe des photorécepteurs et en empêchant la dégénérescence des photorécepteurs sus-jacents dans les modèles de porc (Sharma et al., 2019). Après avoir établi la faisabilité et l'efficacité de l'iPSC-RPE sur un échafaudage PLGA dans un grand modèle animal, en 2020, l'équipe du NIH a lancé des essais cliniques de phase I/IIa pour tester l'innocuité de la transplantation autologue de l'iPSC-RPE dans 20 cellules sèches. Patients atteints de DMLA (numéro d'essai clinique national : NCT04339764). Cet essai clinique marque le premier et, au moment de cette publication, le seul essai clinique de phase I/IIa aux États-Unis à tester des cellules autologues dérivées d'iPSC chez des patients et ouvre simultanément la porte à d'autres approches de greffe sur échafaudage utilisant iPSC- cellules dérivées.

Ii Neurones dopaminergiques dérivés d'iPSC pour la maladie de Parkinson

La deuxième thérapie cellulaire autologue dérivée d'iPSC transplantée chez un humain consistait en des cellules progénitrices (mDAP) dopaminergiques du mésencéphale dérivées d'iPSC, transplantées dans le putamen d'un homme de 69 ans avec une histoire de 10 ans de la maladie de Parkinson ( PD) (Schweitzer et al., 2020). La MP est une maladie neurodégénérative progressive affectant environ 7 à 10 millions de patients dans le monde (Dorsey, Sherer, Okun et Bloemd, 2018). La dégénérescence des neurones dopaminergiques entraîne des symptômes moteurs tels que des tremblements et une bradykinésie. Au moment où les symptômes sont devenus suffisamment importants pour conduire à un diagnostic, ∼ 60 % des neurones mDA ont dégénéré (Engelender & Isacson, 2017 Osborn et al., 2020).Le développement actuel de la thérapie cellulaire pour la MP s'appuie sur une histoire d'expérimentation de plus de 30 ans, au cours de laquelle des neurones mDA de fœtus ont été transplantés chez des patients atteints de MP (Freed et al., 1992 Hagell et al., 2000 Hallett et al., 2014 Kefalopoulou et al. , 2014 Kordower et al., 1998 Li et al., 2016 Lindvall et al., 1990 Mendez et al., 2005 Piccini et al., 1999 Redmond, Vinuela, Kordower et Isacson, 2008 ). Les suivis à long terme et la collecte de données sont essentiels pour évaluer l'innocuité et l'efficacité de ces greffes, car les cellules peuvent mettre des mois ou des années à s'intégrer dans les voies neuronales du patient (Barker, Barrett, Mason, & Björklund, 2013 Politis & Piccini , 2012 Politis et al., 2010 ). Ainsi, l'intérêt d'études telles que celles menées par Politis et al. évaluer l'innocuité et l'efficacité chez les patients de 15 ans et plus après la transplantation (Politis & Piccini, 2012 Politis et al., 2010). Bien que les patients suivis souffraient encore de certains des symptômes non moteurs de la MP liés à la régulation du sommeil et des émotions, le soulagement des symptômes moteurs était de longue durée. Des améliorations positives ont été mesurées par la neuroimagerie TEP de l'absorption de dopamine et des scores réduits sur l'échelle d'évaluation unifiée de la maladie de Parkinson (UPDRS). De plus, l'imagerie post-mortem des tissus cérébraux de patients ayant reçu des greffes de tissus fœtaux 4 à 14 ans plus tôt était conforme à ces résultats cliniques, montrant que le tissu transplanté était sain et non atrophié et exprimait d'importants transporteurs de dopamine (DAT) (Hallett et al. ., 2014 ). Bien que ces résultats soient prometteurs, les transplantations fœtales sont limitées par des préoccupations éthiques et pratiques et nécessitent que les patients subissent une immunosuppression. Une approche autologue basée sur l'iPSC pour le développement de la thérapie cellulaire mDA permettrait de relever ces défis.

En 2018, des mDAP autologues dérivés d'iPSC ont été transplantés d'abord dans l'hémisphère gauche d'un patient parkinsonien de 69 ans, puis dans l'hémisphère droit 6 mois plus tard (Schweitzer et al., 2020). Cette étude a été dirigée par Kwang-Soo Kim au McLean Hospital (Harvard Medical School) en collaboration avec les équipes de Bob Carter et Jeff Schweitzer au Massachusetts General Hospital. Les iPSC ont été générés à partir de fibroblastes récoltés à partir d'une biopsie cutanée et différenciés en mDAP à l'aide d'un protocole de 28 jours conforme aux bonnes pratiques de fabrication (BPF) (Song et al., 2020). Au jour 9, les cellules ont été traitées avec de la quercétine pour éliminer toutes les iPSC indifférenciées. Les iPSC-mDAP spécifiques au patient et les mDAP allogéniques humains dérivés de l'ESC ont été transplantés dans des souris humanisées allogéniques et des souris humanisées par des patients, les deux groupes sans immunosuppression. L'imagerie de coupes de cerveau de souris 2 semaines après la transplantation a montré le rejet des deux types de greffe chez les souris humanisées allogéniques et la survie des seuls iPSC-mDAP spécifiques au patient chez les souris humanisées par le patient. Les mesures cliniques du patient parkinsonien ont été prises à 1, 3, 6, 9 et 12 mois après la transplantation, puis à des intervalles de 6 mois. Le score UPDRS autodéclaré du patient est passé de 60 au moment de l'implantation à 2 au cours du suivi de 24 mois, indiquant une amélioration des symptômes. Les auteurs mettent en garde de manière responsable contre le fait de tirer des conclusions étendues à partir des résultats d'un seul patient. Néanmoins, en l'absence d'événements indésirables graves à ce jour, cette étude est une étape importante dans le développement de thérapies cellulaires autologues dérivées d'iPSC pour la MP.

Des thérapies cellulaires autologues iPSC-mDA pour la MP sont également développées par Ole Isacson et Penelope Hallett, codirecteurs du Neuroregeneration Research Institute de l'hôpital McLean (Harvard Medical School), ainsi que par Aspen Neuroscience. En 2015, l'équipe d'Isacson et Hallett a publié la première démonstration de neurones dopaminergiques autologues fonctionnels dérivés d'iPSC après transplantation dans un modèle primate non humain de MP (Hallett et al., 2015). Les iPSC autologues ont été dérivés de trois singes cynomolgus parkinsoniens (CM). Pour tester l'efficacité des deux protocoles de différenciation, des échantillons de cellules d'un CM ont été différenciés en utilisant le protocole de 49 jours de Cooper et al. (2010), et les échantillons de cellules des deux CM restants ont été différenciés à l'aide du protocole de 30 jours de Sundberg et al. (2013). Les cellules ont été transplantées dans le putamen des CM parkinsoniens sans immunosuppression. Une amélioration des symptômes moteurs de type MP a été observée dès 6 mois après la transplantation et jusqu'à 2 ans. La neuroimagerie TEP a montré une augmentation des sites de liaison DAT (Hallett et al., 2015). L'analyse post-mortem du cerveau à 2 ans après la chirurgie a montré la survie des neurones dopaminergiques greffés et l'expression de marqueurs importants. L'équipe d'Isacson et Hallett a également démontré une amélioration fonctionnelle après la transplantation dans des modèles de primates non humains avec 8 ans de MP chronique dans le cadre d'études précliniques visant à développer une thérapie cellulaire autologue à base d'iPSC pour la MP (Osborn et al., 2020). Ils ont récemment reçu une subvention de 6 millions de dollars du NIH pour soutenir leurs études chez l'homme, qui utiliseront des iPSC autologues comme matériau de départ pour le produit de thérapie cellulaire.

Jeanne Loring du Scripps Research Institute a co-fondé Aspen Neuroscience en 2018, qui a levé une série A de 70 millions de dollars pour développer une thérapie de remplacement neuronal autologue dérivée d'iPSC pour la MP (Loring, 2018). Aspen Neuroscience génère des iPSC à partir de fibroblastes dermiques à l'aide d'un modèle exclusif basé sur l'intelligence artificielle (IA) pour évaluer la pluripotence (Müller et al., 2011). Aspen a deux types de cellules dérivées d'iPSC dans son pipeline thérapeutique : une thérapie neuronale iPSC-DA autologue pour la MP idiopathique, qui affecte 85 % à 90 % des patients atteints de MP, et une thérapie neuronale iPSC-DA autologue modifiée pour la MP génétique, qui affecte 10 à 15 % de la population de la MP et se qualifie pour la désignation de médicament orphelin de la Food and Drug Administration (FDA) des États-Unis (Federoff, 2020). L'équipe de Loring utilise des protocoles de différenciation des neurones dopaminergiques et des analyses de contrôle qualité (CQ) basées sur la génomique pour évaluer la sécurité des lignées iPSC spécifiques au patient et des cellules dérivées d'iPSC (Bhutani et al., 2016 Loring, 2018). En préparation d'un dossier de recherche sur un nouveau médicament (IND) pour commencer les essais cliniques, l'équipe de Loring a généré des iPSC à partir de 10 patients et a développé des critères de libération de CQ pour le produit cellulaire final (Loring, 2018).

Iii Plaquettes dérivées d'iPSC pour la thrombocytopénie

La troisième greffe inhumaine de cellules autologues dérivées d'iPSC était une étude sur un seul patient menée par l'équipe de Koji Eto au CiRA, en collaboration avec l'hôpital universitaire de Kyoto, en 2019 (numéro d'identification de l'essai clinique : jRCTa050190117). Le patient souffrait d'anémie aplasique, une maladie rare caractérisée en partie par une thrombocytopénie (faible numération plaquettaire), et compliquée par une réfractarité à la transfusion plaquettaire (PTR) (Hod & Schwartz, 2008 Stasi, 2012). L'allotransfusion de plaquettes provenant de donneurs de sang est le traitement standard de la thrombocytopénie (Estcourt et al., 2018 ). Cependant, entre 5 % et 15 % des patients recevant des transfusions de plaquettes développent une réfractarité, dans laquelle une réponse allo-immune entraîne le rejet des plaquettes transfusées immuno-incompatibles (Pavenski et al., 2013 Saito et al., 2002 Stanworth, Navarrete, Estcourt , & Marsh, 2015 ).

Le patient a reçu trois doses de plaquettes autologues dérivées d'iPSC : 1 × 10 10 plaquettes, 3 × 10 10 plaquettes 3 mois plus tard, puis 1 × 10 11 plaquettes 5 mois après la deuxième dose. Les iPSCs ont été générés à l'aide de cellules mononucléées du sang périphérique (PBMC) et de plasmides épisomiques. Les iPSCs ont ensuite été différenciés en mégacaryocytes, qui ont été développés et cryoconservés en tant que banque de cellules maîtresses (MCB). Les mégacaryocytes pouvaient ensuite être décongelés, proliférés jusqu'à 10 9 à 10 10 cellules et différenciés en plaquettes dans un bioréacteur peu de temps avant la transfusion. En préparation de la transfusion, les plaquettes dérivées de l'iPSC ont été purifiées, concentrées, lavées et irradiées. Un suivi d'un an évaluant l'innocuité et l'efficacité de l'essai sur un seul patient est prévu pour début 2021 (Clinical Trial Identification Number : jRCTa050190117 Clinical research for the transfer of autologous iPS cell-derived platelets to a thrombocytopenia patient, 2020).

B Indications aux stades précoces (précliniques) du développement

I Kératinocytes et fibroblastes dérivés d'iPSC pour l'épidermolyse bulleuse

L'épidermolyse bulleuse héréditaire (EB) est un groupe de maladies cutanées rares, incurables et potentiellement mortelles, caractérisées par des cloques et des cicatrices sévères (Fine, 2010). Les plaies cutanées chroniques s'apparentent à des brûlures thermiques ou chimiques. La gravité des symptômes varie selon les sous-types et au sein de ceux-ci, certains entraînant la mort dans la petite enfance. Une grande partie du traitement disponible se concentre sur la gestion de la douleur, mais plusieurs études in vitro et in vivo utilisant des modèles murins soutiennent une approche thérapeutique cellulaire (Bilousova & Roop, 2014 Jacków et al., 2019 Sebastiano et al., 2014 Shinkuma, 2015 Tolar et al., 2014 Torkelson et al., 2019 Umegaki-Arao et al., 2014 Vanden Oever, Twaroski, Osborn, Wagner et Tolar, 2018 Wenzel et al., 2014 ). La peau est un organe idéal pour développer des thérapies cellulaires : semblable à l'œil, elle est facile d'accès et facile à surveiller. Chaque sous-type d'EB est associé à diverses mutations génétiques, qui devraient être corrigées dans une thérapie cellulaire autologue (Fine, 2010). Plusieurs groupes de recherche développent des thérapies cellulaires dérivées d'iPSC autologues modifiées par des gènes pour l'EB (Jacków et al., 2019 Roop, Bilousova, & Kogut, 2019 Sebastiano et al., 2014).

L'équipe d'Angela Christiano à l'Université de Columbia a utilisé des vecteurs épisomiques pour dériver les iPSC des fibroblastes de deux patients atteints d'EB dystrophique récessive (RDEB). Le RDEB est un sous-type sévère caractérisé par des mutations affectant la production de collagène de type VII (Jacków et al., 2019). Jacków et ses collègues ont testé les approches CRISPR-Cas9 basées sur les plasmides et les ribonucléoprotéines pour l'édition de gènes et ont différencié les iPSC corrigés des gènes en kératinocytes et en fibroblastes à l'aide de protocoles de 60 jours et ∼ 30 jours, respectivement. Les kératinocytes et fibroblastes dérivés d'iPSC ont été utilisés pour générer des équivalents de peau humaine 3D (HSE). Lorsqu'elles ont été greffées sur des souris immunodéficientes, les HSE ont montré une restauration fonctionnelle de l'expression du collagène et une morphologie dermique normale. Aucune tumeur n'a été observée 9 mois après la greffe, un résultat prometteur pour le développement d'une thérapie cellulaire sûre.

L'équipe d'Anthony Oro à l'Université de Stanford a reçu une subvention de 5 millions de dollars du California Institute for Regenerative Medicine (CIRM) pour traduire en clinique une thérapie cellulaire autologue à base d'iPSC modifiée par gène pour le RDEB (Oro, s.d.). Dans leur publication de 2014, l'équipe d'Oro a utilisé une méthode de reprogrammation lentivirale excisable pour générer des iPSC de qualité GMP à partir de biopsies cutanées spécifiques au patient (Sebastiano et al., 2014). Le gène muté a été corrigé à l'aide d'une approche basée sur le virus adéno-associé (AAV) excisable. Un protocole d'environ 110 jours a été utilisé pour différencier les iPSC à gène corrigé en kératinocytes, qui ont réussi à former des feuilles de peau in vitro. Les kératinocytes dérivés d'iPSC ont également été capables de reconstruire une peau mature lorsqu'ils ont été greffés sur des souris immunodéprimées, et les greffons ont survécu pendant 3 semaines après la transplantation. Le financement de la subvention du CIRM sera utilisé pour effectuer des études in vivo supplémentaires en vue d'une réunion pré-IND avec la FDA.

Les équipes de Ganna Bilousova et d'Igor Kogut à la faculté de médecine de l'Université du Colorado, en collaboration avec Dennis Roop, directeur du Gates Center for Regenerative Medicine, traduisent également une thérapie autologue basée sur l'iPSC en clinique pour le RDEB. Kogut et ses collègues ont développé une technologie basée sur l'ARN cliniquement pertinente capable de reprogrammer ∼90% des fibroblastes primaires humains plaqués individuellement, un niveau sans précédent étant donné que les efficacités de reprogrammation sont généralement des fractions de pour cent ou à un seul chiffre (Kogut et al., 2018). Bilousova et ses collègues ont été les premiers à publier une démonstration de la différenciation des iPSC de souris en kératinocytes, une étape critique pour faire avancer les thérapies cellulaires dérivées des iPSC pour l'EB en clinique. L'équipe de l'Université du Colorado développe actuellement des greffes de peau composites à partir de kératinocytes et de fibroblastes dérivés d'iPSC spécifiques au patient pour la transplantation (Roop et al., 2019). La reprogrammation et la correction des gènes sont effectuées simultanément à l'aide de la technologie propriétaire d'ARN. Les iPSC modifiées par le gène résultantes sont différenciées en kératinocytes et fibroblastes (Kogut et al., 2018 Roop et al., 2019). L'équipe de l'Université du Colorado explore actuellement la faisabilité d'un applicateur à pulvérisation d'AVITA Medical pour l'administration de kératinocytes et de fibroblastes dérivés d'iPSC dans des modèles murins de RDEB (Roop et al., 2019 Sood et al., 2015).

Ii iPSC/papilles dermiques dérivées de la crête neurale pour l'alopécie

La chute des cheveux, ou alopécie, est un problème important qui touche près de 20 % de la population. Des études mesurant l'impact de la perte de cheveux sur la qualité de vie révèlent des effets négatifs à long terme, notamment une faible confiance en soi, une conscience de soi accrue et une prévalence accrue de dépression (Marks et al., 2019 Schmitt, Ribeiro, Souza, Siqueira, & Bebber, 2012 Williamson, Gonzalez, & Finlay, 2001 ). L'extraction d'unités folliculaires (FUE), dans laquelle des unités folliculaires individuelles sont récoltées dans une région du cuir chevelu d'un patient et transplantées dans une section différente du cuir chevelu du même patient, fournit une solution peu invasive pour la greffe de cheveux (Rassman et al., 2002). Cette procédure permet de valider une approche de la perte de cheveux basée sur la thérapie cellulaire autologue. Cependant, les patients souffrant de perte de cheveux sévère peuvent ne pas avoir suffisamment de follicules pour une transplantation FUE. Une approche autologue basée sur l'iPSC résout ce problème, permettant de générer de grands volumes de follicules pileux spécifiques au patient pour traiter les patients souffrant d'une perte de cheveux sévère. Stemson Therapeutics, basé sur une technologie développée dans le laboratoire d'Alexey Terskikh au Sanford Burnham Prebys Medical Discovery Institute, poursuit une telle approche (Gnedeva et al., 2015 ). Gnedeva et ses collègues ont développé un protocole en deux phases de 28 jours pour différencier les CSE et les iPSC en cellules de papilles dermiques (DP) induisant des cheveux adhérentes via un stade intermédiaire de cellules de la crête neurale (NC) (Gnedeva et al., 2015). Des suspensions de 5 × 10 5 cellules ESC-DP ont été combinées avec des suspensions de 5 × 10 5 cellules épidermiques et transplantées avec succès dans des souris immunodéficientes, démontrant une capacité à induire la formation de follicules pileux in vivo, une étape passionnante vers la réalisation de greffes de cheveux dérivées d'iPSC. les patients.

Iii Cellules souches myogéniques dérivées d'iPSC pour les dystrophies musculaires

Les dystrophies musculaires sont un groupe de troubles génétiques caractérisés par une fonte musculaire : affaiblissement et rétrécissement des muscles dus à la perte de masse musculaire (Emery, 2002). Les greffes de cellules musculaires dans des modèles murins de dystrophie musculaire remontent à 1989, et les résultats positifs soutiennent une approche de thérapie cellulaire (Partridge, Morgan, Coulton, Hoffman et Kunkel, 1989 Tedesco et al., 2012). Cependant, la transplantation de myoblastes hétérologues chez l'homme n'a pas entraîné d'améliorations fonctionnelles. Ces résultats sont en partie dus au rejet immunitaire, ce qui indique qu'une approche autologue peut être plus prometteuse (Skuk et Tremblay, 2003 Sun, Serra, Lee et Wagner, 2020). Les différentes dystrophies sont caractérisées par des mutations génétiques spécifiques, ce qui signifie qu'une approche autologue nécessiterait une édition de gènes (Emery, 2002 Ghaoui et al., 2015 ). Vita Therapeutics, fondée à l'Université Johns Hopkins et basée sur la technologie développée par Gabsang Lee à la Johns Hopkins School of Medicine et Kathryn Wagner au Kennedy Krieger Institute, développe des thérapies cellulaires modifiées par des gènes pour régénérer les tissus musculaires malades et perdus (brevet américain n° 15/781 709, 2016). En utilisant une combinaison de la technologie iPSC et de l'édition du génome, les cellules spécifiques du patient sont différenciées en cellules souches myogéniques capables de se diviser de manière asymétrique pour générer des cellules satellites et des myoblastes supplémentaires (Choi et al., 2016 Sun et al., 2020). Les myoblastes peuvent alors fusionner, régénérant efficacement les fibres musculaires (Sun et al., 2020). Vita Therapeutics vise à cibler des types spécifiques de dystrophies musculaires, y compris les dystrophies musculaires des ceintures (LGMD), la plus hétérogène des dystrophies musculaires, et a récemment reçu la désignation de médicament orphelin de la FDA pour lancer une étude clinique évaluant l'utilisation de l'iPSC dérivé cellules souches myogéniques pour la dystrophie musculaire de Duchenne (DMD), qui est la forme la plus courante de dystrophie musculaire et affecte généralement les jeunes garçons (Emery, 2002 Sun et al., 2020).

Iv Précurseurs de photorécepteurs dérivés d'iPSC pour la cécité dégénérative de la rétine

Les troubles dégénératifs rétiniens, tels que la rétinite pigmentaire, la maladie de Stargardt et l'amaurose congénitale de Leber, sont caractérisés par une cécité incurable causée par le dysfonctionnement ou la perte des photorécepteurs sensibles à la lumière (den Hollander, Roepman, Koenekoop, & Cremers, 2008 Hartong, Berson, & Dryja, 2006 Tsang & Sharma, 2018 ). Dans de nombreux cas, les neurones de la couche interne de la rétine, dont le travail consiste à connecter les photorécepteurs au cerveau, restent intacts après la dégénérescence des photorécepteurs, encourageant la poursuite d'une approche de thérapie cellulaire basée sur la transplantation de photorécepteurs (Cideciyan et al., 2007 Mullins et al., 2012). Au moins deux études ont démontré la faisabilité technique et l'innocuité, sinon l'efficacité, de la transplantation de photorécepteurs cadavériques chez des patients humains atteints de rétinite pigmentaire (Berger, Tezel, Del Priore, & Kaplan, 2003 Kaplan, Tezel, Berger, Wolf, & Del Priore, 1997 ). Plusieurs études ont démontré la capacité des précurseurs de photorécepteurs dérivés de PSC transplantés à restaurer la fonction rétinienne et à améliorer la vision dans des modèles animaux de dégénérescence rétinienne (Lamba, Gust et Reh, 2009 Pearson et al., 2012 Tucker et al., 2011). Une approche autologue pourrait éviter certains des problèmes conduisant à une mauvaise survie à long terme après la transplantation, ce qui peut être dû en partie aux réponses immunitaires (Santos-Ferreira, Borsch et Ade, 2017 West et al., 2010). Le laboratoire de Budd Tucker à l'Université de l'Iowa a développé un protocole actuel de qualité GMP (cGMP) pour générer des iPSC spécifiques au patient et des précurseurs de photorécepteurs pour soutenir le développement d'une approche autologue. Des échantillons de fibroblastes ont été obtenus auprès de 35 patients atteints de dégénérescence rétinienne héréditaire et étendus dans des conditions conformes aux cGMP (Wiley et al., 2016). Le virus Sendai a été utilisé pour générer des clones iPSC à partir des échantillons de patients. Les iPSC ont été différenciés à l'aide d'un protocole basé sur une suspension 3D d'une durée d'au moins 16 semaines, ce qui a donné des organoïdes rétiniens composés principalement de cellules précurseurs des photorécepteurs post-mitotiques. Des précurseurs de photorécepteurs dérivés d'iPSC de huit patients différents ont été transplantés dans des souris immunodéprimées. Les greffes n'ont entraîné aucune formation de tumeur et n'ont démontré aucune cellule pluripotente dans la population cellulaire finale, une préoccupation importante pour les produits de thérapie cellulaire (Wiley et al., 2016).


Analyse structurale de molécules d'ADN marquées par impulsions

Une approche consiste à marquer l'ADN nouvellement synthétisé dans une population asynchrone de molécules d'ADN pendant de courtes périodes (appelées étiquetage d'impulsions ), isoler complété molécules d'ADN puis suivre l'apparition de marqueur radioactif dans notamment des fragments de restriction. Étant donné que les molécules ne se répliquent pas de manière synchrone, certaines des molécules d'ADN seront complétées au cours d'une courte impulsion de marquage, et les autres incorporeront le radiomarqueur en interne. Comme le montre la figure 6.2, les molécules d'ADN qui ont terminé la réplication pendant le marqueur d'impulsion courte auront un marqueur radioactif dans le fragment de restriction contenant l'extrémité de la réplication. Lorsque les molécules de réplication sont marquées pendant une durée plus longue (impulsion plus longue), les molécules d'ADN terminées auront un marqueur radioactif non seulement dans les fragments de restriction contenant l'extrémité, mais également dans les fragments adjacents. L'origine de réplication ne sera marquée que si le temps d'impulsion est prolongé jusqu'à la période nécessaire à la synthèse complète de la molécule d'ADN. Ainsi, dans cette procédure, lorsque des molécules à réplication asynchrone sont marquées pour une série de périodes d'impulsions de longueur croissante et que les molécules d'ADN terminées sont examinées à la fin de chaque impulsion, le terminus de la réplication sera marqué au plus tôt, tandis que ceux contenant un l'origine sera étiquetée en dernier.

Graphique 6.2. Distribution de la radioactivité dans les molécules d'ADN filles marquées par impulsions à différents moments de la synthèse. Les fines lignes horizontales noires représentent des molécules d'ADN non marquées et se répliquant à divers stades d'achèvement. L'origine (ori) est à gauche et le terminus (terme) est à droite. Les lignes grises épaisses sont des parties radiomarquées des molécules d'ADN en cours de réplication. Après une impulsion de 5 min, certaines des molécules d'ADN présentées au temps 0 ont terminé la synthèse. Ceux-ci sont collectés, digérés par une endonucléase de restriction aux sites marqués par des traits verticaux. Notez que les fragments de restriction contenant l'extrémité de réplication auront un marqueur radioactif après une courte impulsion. Dans le troisième panneau, les résultats d'une période d'étiquetage d'impulsion plus longue sont affichés. Le temps de marquage a été suffisamment long pour que les molécules qui ont initié la synthèse après l'ajout du marqueur radioactif achèvent la synthèse. Ces dernières molécules auront un marqueur dans des fragments de restriction contenant l'origine. Par conséquent, dans ce protocole, l'étiquette apparaît dans les fragments de restriction contenant l'origine uniquement à des périodes d'impulsion plus longues.

Ce concept est issu d'une approche utilisée par Dintzis pour mesurer la direction de la synthèse des protéines au milieu des années 1960 (voir chapitre V dans la troisième partie). Cela peut être déroutant, alors essayons une analogie. Imaginez que 20 étudiants rédigent des essais à l'aide de logiciels de traitement de texte configurés pour utiliser des lettres noires. Ils sont tous à des stades différents de la rédaction de leurs articles, et ils ne révisent ni ne modifient leurs essais - ils les rédigent simplement du début à la fin. A un moment défini, tous les traitements de texte sont passés à l'utilisation de lettres rouges. Au fur et à mesure que chaque étudiant termine son papier, il l'imprime et le rend. Les essais des étudiants qui étaient presque terminés lorsque la couleur de la police a été changée auront du texte rouge uniquement à la fin. Les dissertations des étudiants qui étaient à mi-chemin de leur dissertation lorsque la couleur a été changée auront un texte en rouge pour la dernière moitié. Ceux des étudiants qui commençaient tout juste leurs essais lorsque la couleur des lettres a été changée auront un texte rouge partout, y compris le début. Le passage des lettres au rouge est analogue au marquage par impulsion des molécules d'ADN avec la radioactivité. Tout comme les essais terminés peu de temps après le changement de couleur n'afficheront de texte en rouge qu'à la fin, de même les molécules d'ADN qui terminent la réplication au cours d'une impulsion courte auront un marqueur radioactif à leur extrémité.

Une fois que les enzymes de restriction ont été découvertes au début des années 1970, Dana et Nathans ont réalisé qu'ils pouvaient les utiliser pour diviser le virus du polyome de mammifère, le virus simien 40 (SV40) en fragments discrets. Ils ont utilisé la procédure de marquage par impulsions suivante pour identifier l'origine et les terminaisons de la synthèse d'ADN viral. Des cellules de singe en culture ont été infectées avec du SV40 puis marquées par impulsions avec de la [3H]thymidine pendant 5, 10 et 15 min. Les molécules d'ADN viral complètes ont été isolées, digérées avec des endonucléases de restriction de H. grippe (un mélange de De derrière II et De derrière III), séparés sur un gel de polyacrylamide, et la quantité de [ 3 H] incorporée dans l'ADN a été déterminée. Pour normaliser les différentes tailles et compositions en bases des fragments de restriction, les comptes de [ 3 H] ont été divisés par la quantité de [ 32 P] dans les mêmes fragments de restriction à partir d'ADN uniformément marqué au [ 32 P] phosphate. Comme discuté ci-dessus, lorsque la longueur du marqueur d'impulsion est plus courte que le temps requis pour la synthèse complète de la molécule d'ADN, le marqueur apparaîtra d'abord dans les fragments les plus proches de l'extrémité. Au fur et à mesure que l'ADN marqué par impulsion (nouvellement synthétisé) apparaît dans complété Molécules d'ADN, un gradient de marqueur a été observé à travers les molécules terminées, comme le montrent les figures et le tableau suivants adaptés de leur article.

Figure 6.3 Carte de restriction du SV40

Tableau 6.1. Apparition de radiomarqueurs dans des fragments de restriction de molécules d'ADN SV40 terminées. La quantité relative de marqueur d'impulsion de chaque fragment de restriction est donnée ci-dessous (la quantité relative de marqueur d'impulsion est le rapport 3 H/32 P de chaque fragment, corrigé pour la teneur en thymidine et normalisé à 1 pour le fragment A).


Résultats

Construction d'une souche recombinante de C. thermocellum exprimant une LC-cutinase sécrétoire

Une cutinase thermophile (LCC) a été isolée à l'origine à partir d'un métagénome de compost végétal (Sulaiman, et al., 2012 ) et a une activité élevée dans la dégradation du PET jusqu'à 70°C (Sulaiman, et al., 2014 Wei, et al., 2019b ). Ainsi, LCC a été choisi pour être exprimé en C. thermocellule. C. thermocellule est connu pour sa capacité à dégrader très efficacement la lignocellulose en produisant une structure multiprotéique extracellulaire, le cellulosome (Yoav, et al., 2017 ). Parce que l'exoglucanase Cel48S est le composant le plus abondant dans le cellulosome de C. thermocellule (Liou, et al., 2018 ), la séquence peptidique signal de Cel48S a été utilisée pour la production sécrétoire de LCC. De plus, un puissant promoteur du gène exprimé de manière constitutive Clo1313_2638 (Olson, et al., 2015 ) a été sélectionné pour obtenir une expression de haut niveau de LCC dans C. thermocellule. Comme le montre la figure 1A, le plasmide pHK-LCC a été construit après vérification par PCR et a ensuite été transformé en C. thermocellule DSM1313 pour construire la souche cible DSM1313::pHK-LCC.

Construction du plasmide pHK-LCC exprimant le LCC et expression extracellulaire du LCC actif dans C. thermocellule.

A. Construction de pHK-LCC. SP, peptide signal, P2638, séquence promotrice du gène Clo1313_2638, Ter, terminateur, Rep Ori, l'origine du réplicon de E. coli, RepB, ​​origine du réplicon de C. thermocellule, CAT, gène de résistance au thiamphénicol. L'insertion de la construction 'P2638-SP-lcc' a été vérifié par PCR avec les amorces seqF/R et la taille théorique du produit PCR était de 1,3 kb. L'analyse sur gel du produit PCR est présentée à droite.

B. Analyse SDS-PAGE de lysats cellulaires et de protéines extracellulaires de DSM1313 et DSM1313 :: pHK-LCC colorés au bleu brillant de Coomassie.

C. Analyse de coloration au colorant Fast-Red du gel de protéine contre l'acétate de 1-naphtyle pour visualiser l'activité estérolytique. Pistes 1 et 2, surnageant de culture de DSM1313 et DSM1313::pHK-LCC respectivement pistes 3 et 4, lysat cellulaire de DSM1313 et DSM1313::pHK-LCC respectivement. Dix ug de protéine ont été chargés dans chaque piste.

La souche modifiée et la souche de type sauvage DSM1313, qui a servi de contrôle négatif, ont été cultivées dans du milieu GS-2 pour étudier l'expression et la sécrétion de la protéine LCC. Selon les résultats de coloration à base de colorant Fast-Red (Fig. 1C), le LCC actif était visible sous la forme d'une bande de protéine violette à environ 28 kDa dans le surnageant de DSM1313::pHK-LCC, mais non détecté dans le lysat cellulaire correspondant, indiquant que la protéine LCC produite a été sécrétée avec succès de manière extracellulaire dans le surnageant de la culture. En revanche, aucune activité LCC n'a été observée dans les protéines intra- ou extracellulaires de la souche de type sauvage. Ces résultats ont indiqué l'expression fonctionnelle de LCC en tant que protéine entièrement sécrétoire par C. thermocellule DSM1313::pHK-LCC.

Influence du PET et des hydrolysats de PET sur la croissance de C. thermocellum

Clostridium thermocellum n'a pas de capacité native de dégradation et d'assimilation de la TEP sur la base de ses informations génomiques. La dégradation enzymatique du PET libérera du TPA et de l'EG en tant que matières premières monomères des polymères PET (Wei & Zimmermann 2017a , 2017b ) qui peuvent potentiellement influencer la croissance de C. thermocellule. Dans notre dispositif expérimental, nous avons utilisé 50 mg de films PET dans un tube en verre anaérobie contenant un milieu de culture de 10 ml au total. Par conséquent, le rendement maximum théorique de TPA et d'EG a été estimé à 25,9 mM selon la masse moléculaire d'une unité récurrente de PET de 192,2 g mol -1 . En conséquence, nous avons déterminé la croissance cellulaire en termes de densité optique à 600 nm (DO600) en présence de 20 mM de TPA, d'EG, les deux, ou de films PET dans les 32 premières heures de culture. Comme le montre la figure 2, C. thermocellule Le DSM1313 présentait une forme similaire de courbe de croissance indépendante de la présence de tout composé lié au PET. Brièvement, une phase de latence a été observée jusqu'à 12 h après l'inoculation suivie d'une croissance rapide jusqu'à 20 h de temps de culture avec une DO maximale600 d'environ 2,2. Par la suite, il y avait une nette tendance à la diminution progressive de la DO600 jusqu'à 32 h pour atteindre une valeur finale comprise entre 1,6 et 1,8, suggérant une lyse cellulaire possible sans autre ajout de nutriment. De plus, aucune différence significative n'a été observée dans les évolutions temporelles du changement de pH pendant la culture avec ou sans films de PET amorphe (Fig. 2).

Dégradation de films PET amorphes à l'aide d'un biocatalyseur à cellules entières C. thermocellum modifié

L'ingénierie C. thermocellule la souche DSM1313::pHK-LCC a été utilisée pour dégrader un film de PET d'un poids initial d'environ 50 mg. L'incubation a duré 14 jours à 60°C. L'évolution dans le temps de la perte de poids du PET a été montrée sur la figure 3A. Une perte de poids évidente peut être surveillée même après 2 jours d'incubation avec une tendance à la hausse à peu près continue jusqu'à 14 jours pour atteindre une perte de poids maximale d'environ 62 % (≈ 31 mg).

Dégradation des films PET amorphes par C. thermocellule DSM1313::pHK-LCC.

A. Évolution dans le temps de la perte de poids relative déterminée par gravimétrie. Environ 50 mg de films PET ont été initialement complétés.

B. Évolution dans le temps des produits de dégradation absorbant les UV libérés déterminés par HPLC dans le surnageant de culture (colonnes empilées) ainsi que les valeurs de somme calculées sur la base de la détermination de la perte de poids (courbe en pointillés, à partir du même ensemble de données avec le panneau A). Les concentrations spécifiques de TPA et de MHET sont répertoriées dans le tableau S1.

C. Cours dans le temps de l'activité estérolytique volumétrique contre p-NPB et changements de pH déterminés dans le surnageant de culture. Les barres d'erreur indiquent l'écart type dérivé d'au moins des déterminations en triple.

D. Analyse de l'activité estérolytique spécifique déterminée par coloration Fast-Red. SDS-PAGE des surnageants de culture (10 g de protéine chargée dans chaque piste) retirés après culture pendant différentes périodes de temps après la coloration estérolytique avec le colorant Fast-Red contre l'acétate de 1-naphtyle comme substrat. Les intensités des bandes violettes calculées par le logiciel Quantity One indiquent la quantité d'activités spécifiques résiduelles du LCC extracellulaire.

Les surnageants de culture prélevés à un intervalle de 2 jours ont été soumis à une analyse HPLC pour identifier les produits de dégradation absorbant les UV solubles. Les temps de rétention des standards, ainsi qu'une courbe d'étalonnage pour l'analyse HPLC, ont été préparés en utilisant du TPA pur acheté dans le commerce (Fig. S2). Comme le montre la figure 3B, le TPA et le MHET étaient détectables dans le surnageant de culture après plus de 2 jours de culture. Sur la base de la masse moléculaire d'une unité répétitive PET de 192,2 g mol -1 , la courbe de perte de poids représentée sur la figure 3A a été convertie en une courbe en pointillés présentant la quantité correspondante de produits absorbant les UV libérés (figure 2B, tableau S1) , ce qui est en bon accord quantitatif avec la somme déterminée de TPA et MHET. Des valeurs de somme légèrement inférieures des produits de dégradation absorbant les UV déterminés par HPLC étaient attendues en raison de la présence d'une petite fraction de di-éthylène glycol dans les échantillons de PET utilisés dans cette étude, comme décrit précédemment (Wei, et al., 2019a ). Le changement de pH a également été déterminé dans le surnageant de culture avec une chute rapide au cours des 2 premiers jours de 7,4 à 6,5 suivie d'une diminution continue plus lente à environ 6,2 après 14 jours de culture (Fig. 3C). Parce que le pH est une mesure logarithmique de la concentration actuelle de H3O+, ce résultat a montré un bon accord avec les quantités de TPA déterminées comme indiqué par un coefficient de corrélation élevé de 0,914 (données non présentées).

Comme le montre la figure 3D, l'intensité de la bande LCC a été considérée comme reflétant l'activité spécifique car une quantité égale de 10 ug de protéine totale a été chargée dans chaque piste. Des intensités de bande LCC similaires ont été observées dans les surnageants de culture après 1, 2 et 4 jours d'incubation, et la bande de 8 jours présentait encore une intensité de 88,2 % de celle obtenue avec la bande de 1 jour. En conséquence, l'activité estérolytique volumétrique dans le surnageant de culture a augmenté avec la croissance cellulaire le premier jour d'incubation (Fig. 2), a maintenu sa valeur maximale (1,01 U ml -1 ) au deuxième jour d'incubation et a progressivement diminué. à 0,39 U ml -1 après 8 jours d'incubation, soit 38,9 % de l'activité maximale (Fig. 3C), bien qu'une activité spécifique LCC maintenue ait été détectée dans le système de dégradation jusqu'à 8 jours (Fig. 3D). La diminution de l'activité LCC pourrait être causée par la désactivation thermique ou par les protéases libérées des cellules lysées après une incubation à long terme. Conformément aux performances de dégradation, comme le montre la figure 3A-B, qui était visible à partir du deuxième jour de la culture, la diminution de l'activité estérolytique dans le surnageant de culture pourrait également être due au transfert de masse du LCC libre à l'enzyme étroitement absorbée. à la surface des films PET, où ils catalysent l'hydrolyse des polyesters.

La figure 4 a montré des changements drastiques dans la morphologie de surface des films PET après 5 jours de culture en présence de l'ingénierie C. thermocellule souche. Les cavités et les trous sont apparus principalement comme un signe initial de l'érosion de surface, de la même manière que les captures SEM de films PET biologiquement dégradés montrées dans des études précédentes (Ronkvist, et al., 2009 Moog, et al., 2019 Wei, et al., 2019a ). Par la suite, les trous d'érosion discrets se sont développés en une surface accidentée continue avec des quantités croissantes de crevasses irrégulières à la suite d'une hydrolyse enzymatique supplémentaire catalysée par le LCC sécrété dans le surnageant de culture jusqu'à la période de culture finale de 14 jours. Contrairement aux captures SEM montrées par Yoshida et al. ( 2016 ), qui indiquait clairement la I. sakaiensis fixation des cellules à la surface des films PET, conçue C. thermocellule les cellules ne se sont pas attachées à la surface du film PET (Fig. S3).


Types de gènes : les 6 principaux types de gènes | La génétique

Les points suivants mettent en évidence les six principaux types de gènes. Les types sont : 1. Gènes complémentaires 2. Gènes en double 3. Gènes polymères 4. Gènes modificateurs 5. Gènes létaux 6. Gènes mobiles.

Type # 1. Gènes complémentaires:

Bateson et Punnett ont croisé deux variétés différentes de pois de senteur à fleurs blanches et ont obtenu un F1 descendance de plantes à fleurs rouges. Sur l'autopollinisation le F1 les plantes ont donné un F2 descendance de 9 plantes à fleurs rouges et 7 à fleurs blanches. Des croisements simples entre la variété à fleurs rouges et les deux variétés différentes à fleurs blanches ont montré que le gène de la couleur rouge était dominant sur le gène de chacune des deux variétés blanches.

Le croisement entre les deux variétés blanches peut s'expliquer en supposant que deux gènes de couleur rouge doivent être présents ensemble, c'est-à-dire qu'ils doivent agir de manière complémentaire l'un par rapport à l'autre. Ainsi, chaque gène contribue indépendamment à quelque chose de différent mais essentiel pour la synthèse du pigment rouge. Si l'un des deux gènes de la couleur rouge est absent, le résultat est une fleur blanche. Cette explication peut être vérifiée en faisant un damier.

L'hérédité de la couleur de la couche d'aleurone dans le maïs démontre également l'interaction de gènes complémentaires. Les couches les plus externes d'endosperme dans les grains de maïs en cours de maturation sont modifiées en un tissu d'aleurone spécialisé, ainsi nommé parce que les cellules ont de riches dépôts de grains d'aleurone. Dans le maïs, la couche d'aleurone est colorée en raison des pigments anthocyaniques dans les cellules et est contrôlée par l'effet complémentaire de deux gènes.

Taper # 2. Gènes en double:

Lorsque deux gènes ou plus ont le même effet sur un trait donné, ils sont appelés gènes dupliqués. Chez le maïs, le gène de l'endosperme jaune est dominant sur l'endosperme blanc. Une plante à endosperme jaune de reproduction pure lorsqu'elle est croisée avec une plante à endosperme blanc donne un endosperme jaune en F1.

Sur l'autopollinisation de F1 hybrides un F2 la génération de 15 endospermes jaunes et 1 blanc est obtenue. L'albumen jaune résulte de deux gènes dominants indépendants Y1 Andy2. Lorsque l'un de ces deux gènes dominants ou les deux ensemble sont présents, un endosperme jaune est produit.

Lorsque seuls les allèles récessifs sont présents à l'état homozygote (y1oui1oui2oui2) il forme un endosperme blanc. Ainsi les gènes dominants Y1 Andy2 ont un effet identique sur la couleur de l'endosperme et sont par conséquent appelés gènes dupliqués ou isogènes.

Chez l'être humain, 3 gènes différents peuvent produire jusqu'à 12 enzymes lactiques déshydrogénases similaires appelées isozymes ou isoenzymes. La lactique déshydrogénase se compose de quatre chaînes polypeptidiques dont chacune est codée par deux gènes différents A et B. Un troisième gène C code pour encore une autre chaîne polypeptidique qui est présente dans la lactique déshydrogénase trouvée dans les cellules germinales mâles.

Taper # 3. Gènes polymères:

Chez Cucurbita pepo (courge d'été), la forme du fruit peut être sphérique ou cylindrique. La forme sphérique du fruit est dominante sur cylindrique et est contrôlée par deux gènes indépendants. Ainsi, il existe deux variétés différentes de plantes fruitières sphériques.

Lorsque deux de ces plantes fruitières sphériques génétiquement différentes sont croisées, le F1 la descendance montre une nouvelle forme de fruit—discoïde. Autofécondation de F1 les plantes fruitières discoïdes produit un F2 génération avec les trois formes de fruits, c'est-à-dire discoïde, sphérique et cylindrique dans la proportion 9 : 6 : 1.

Sur les six plantes fruitières sphériques de F2 génération, trois plantes appartiennent à une variété et ont le gène dominant S1. Les trois autres plantes fruitières sphériques appartiennent à une variété génétiquement différente avec un autre gène dominant S2. En raison d'un effet additif des gènes S1 et S2 (également appelé effet polymère), la forme discoïde est produite.

Taper # 4. Modification des gènes:

Au fur et à mesure que de plus en plus d'exemples d'interactions géniques étaient découverts, la notion antérieure selon laquelle un gène contrôle un phénotype indépendamment des autres gènes a dû être rejetée. En réalité, un phénotype observé est le résultat de nombreux processus complexes au sein d'un organisme.Il est donc raisonnable que de nombreux gènes soient impliqués dans l'expression finale d'un trait.

Il existe un grand groupe de gènes qui relèvent d'une rubrique générale ou de modificateurs qui influencent l'activité d'autres gènes et modifient leurs effets phénotypiques. L'effet modificateur peut être quantitatif de sorte que l'expression d'un phénotype est soit augmentée soit supprimée.

Il existe un gène suppresseur récessif (su) chez la drosophile qui supprime l'effet d'un gène mutant pour l'aile velue (Hw) de sorte que même les mouches homozygotes (HwHw) ne développent pas de poils sur leurs ailes.

Le même gène (il est également connu sous le nom de su-Hw) réduit l'expression de quelques autres phénotypes mutants tels que ceux causés par les gènes des nervures des ailes interrompues et des poils fourchus. Un autre gène suppresseur (su-S) chez la drosophile est limité dans son action de sorte qu'il réduit l'expression d'un seul gène dominant qui contrôle la forme de l'œil en étoile.

Chez les êtres humains, l'apparition de brachydactyles mineurs (une forme de brachydactyles dans laquelle seul l'index est plus court) dans les familles norvégiennes est due à un gène dominant B. Il existe un gène modificateur M qui modifie l'effet du gène B pour produire phénotypes variables.

Ainsi, chez les individus porteurs à la fois des gènes B et M, l'index est très raccourci. Les personnes ayant le gène B et les allèles récessifs du gène modificateur (mm) ne présentent qu'un léger raccourcissement du même doigt. Les gènes modificateurs en eux-mêmes ne semblent pas produire de phénotype visible.

Taper # 5. Gènes mortels:

Modifications des rapports mendéliens causées par l'interaction des gènes. Les gènes létaux peuvent également modifier le rapport de base 9:3:3:1 et entraîner la mort d'un organisme.

Je. Mortels dominants:

La couleur du corps jaune chez les souris est dominante sur le brun, mais les souris jaunes ne sont jamais de véritables reproducteurs. Lorsque les souris jaunes sont consanguines, la descendance se compose de souris jaunes et brunes dans un rapport 2 : 1, qui ne correspond à aucune des attentes mendéliennes.

De plus, la taille de la portée après la consanguinité est plus petite d'un quart par rapport à la taille de la portée résultant d'un croisement entre le jaune et le brun. Lorsque des souris jaunes ont été rétrocroisées avec de vraies souris brunes reproductrices, seules des souris jaunes hétérozygotes ont été obtenues.

Pourquoi les souris jaunes homozygotes ne sont-elles jamais nées ? La réponse est venue d'un généticien français L. Cuenot. Il a sacrifié les femelles gestantes Yy après la consanguinité et a examiné les embryons pour déterminer si la mort s'était produite au stade embryonnaire ou non. En effet, un quart des embryons ont été observés à mourir à des stades avancés de développement.

Ainsi, seules des souris hétérozygotes jaunes et brunes dans le rapport 2:1 étaient nées. Le rapport 1:2:1 attendu lors d'un croisement entre deux hétérozygotes n'a jamais été obtenu prouvant l'expression létale du gène jaune homozygote.

Le gène de la brachyurie (I) chez la souris est mortel à l'état homozygote, et lorsqu'il est hétérozygote, l'animal survit, mais avec une queue courte. Les embryons homozygotes pour la brachyurie présentent une absence totale de notocorde, quelques anomalies et meurent in utero. Lorsque deux souris à queue courte hétérozygotes pour la brachyurie sont croisées, la progéniture viable produite présente un rapport phénotypique de 2 queues courtes : 1 queue normale (Fig. 2.4).

Dans de nombreuses plantes, dont le maïs, le soja et l'Antirrhinum (muflier), il existe un gène létal dominant qui interfère avec le processus de photosynthèse et la chlorophylle n'est pas synthétisée. Les jeunes plantules qui émergent d'une graine portant le gène dominant homozygote sont jaunes et meurent à un stade très jeune en raison de la famine. Les plantules hétérozygotes sont de couleur vert clair et capables de survivre.

Dans tous les cas de gènes létaux dominants décrits ci-dessus, l'état homozygote du gène conduit à une mort précoce, alors que l'hétérozygote est viable. L'effet le plus grave qu'un gène puisse avoir est peut-être de provoquer la mort même à l'état hétérozygote. Le gène responsable de la chorée de Huntington chez l'homme s'exprime lorsqu'un seul allèle dominant est présent.

Qu'il soit homozygote ou hétérozygote, le phénotype de la maladie devient visible à l'âge moyen, généralement après quarante ans. L'individu souffre d'insuffisance musculaire, d'arriération mentale et finalement de mort. Étant donné que le début de la chorée de Huntington se situe bien après le début de la période de reproduction, le gène peut être transmis à la prochaine génération de progéniture.

Un autre gène dominant qui provoque l'épiloie chez les êtres humains conduit à la mort dans les premiers stades de la vie, même dans l'état hétérozygote, en raison de graves défauts mentaux, de tumeurs et d'excroissances cutanées anormales. Les gènes létaux dominants qui expriment la létalité à un stade précoce de la vie ne sont pas détectables dans la population.

Ii. Létalité récessive:

Le gène létal récessif reste inaperçu dans la population car il ne produit pas de phénotype visible à l'état hétérozygote. En fait, il peut être transmis par des porteurs hétérozygotes pendant de nombreuses générations sans être détecté. Par conséquent, un plus grand nombre de gènes létaux récessifs sont connus par rapport aux gènes létaux dominants.

Il existe un gène mortel récessif chez l'homme qui provoque la mort des nouveau-nés en produisant des adhérences internes des poumons. Un fœtus homozygote pour ce gène achève son développement embryonnaire à l'aide de l'oxygène fourni par le sang maternel. Mais la mort survient peu de temps après la naissance lorsque les poumons ne fonctionnent plus normalement.

Un tel gène létal récessif est porté chez les individus hétérozygotes sans produire d'effets nocifs. Il n'est détecté que lorsque deux personnes hétérozygotes se marient et qu'environ un quart de leurs enfants meurent après la naissance, car ils reçoivent les deux allèles récessifs de leurs parents.

Un autre gène mortel récessif chez l'homme connu sous le nom de maladie de Tay Sachs provoque la mort de jeunes enfants. Les individus homozygotes pour ce gène sont dépourvus de l'une des enzymes nécessaires au métabolisme normal des corps gras.

Le phénotype de la maladie devient visible après la première année lorsque les matières grasses s'accumulent dans les gaines nerveuses. La transmission de l'influx nerveux est affectée, entraînant une perte de contrôle musculaire et une déficience mentale. En quelques années, l'individu meurt.

Chez l'homme, il existe de bonnes chances d'expression de gènes létaux récessifs chez les descendants de mariages entre cousins ​​germains. L'allèle unique du gène peut avoir été présent chez les ancêtres normaux. Ce n'est que lorsque les deux allèles se combinent dans la progéniture de personnes étroitement apparentées que la létalité s'exprime.

Chez la souris, l'hydrocéphalie est due à un gène létal récessif. Au cours du développement embryonnaire, il y a une croissance anormale du cartilage. Cela conduit à des irrégularités dans la formation du crâne et du cerveau et à une accumulation excessive de liquide céphalo-rachidien. Les embryons portant le gène homozygote ne survivent pas. Les hétérozygotes sont phénotypiquement normaux.

Il existe un gène létal récessif chez les bovins de boucherie (dextre) en Angleterre. Dexter est la race hétérozygote qui est très prisée pour la plus grande quantité de viande de bœuf qu'elle peut produire.

La race bovine commune connue sous le nom de Kerry a deux gènes dominants homozygotes, est normale comme le dextre mais produit moins de viande. Lorsque deux dextres sont croisés, la descendance est constituée de 1 kerry : 2 dexters : 1 bulldog. Le veau bouledogue est porteur de deux gènes létaux récessifs, a des pattes très courtes, quelques anomalies et meurt peu après la naissance.

Iii. Mortels liés au sexe:

Il s'agit d'un système dans lequel le gène létal est porté sur le chromosome sexuel, généralement X. Chez la drosophile, les létals récessifs liés au sexe sont fréquemment utilisés pour détecter les mutations. Un gène létal récessif porté sur le chromosome X est particulièrement important chez les individus mâles hémizygotes car il peut exprimer la létalité lorsqu'un seul allèle est présent.

La présence d'un gène létal lié à l'X peut également modifier le sex-ratio de sorte que davantage de femelles naissent au lieu du ratio attendu de 1 femelle pour 1 mâle. Ainsi, une femelle portant un gène létal récessif produira une descendance dans laquelle la moitié de la progéniture mâle ne serait pas viable.

La perturbation du sex-ratio est clairement visible chez des organismes comme la drosophile qui produisent une grande progéniture. Chez les êtres humains, l'existence de gènes létaux liés au sexe est suspectée dans les familles où les naissances féminines sont beaucoup plus fréquentes que les naissances masculines.

Chez les êtres humains, des effets mortels parmi la descendance peuvent être causés accidentellement par un traitement par rayonnement (rayons X) des organes reproducteurs des parents. Selon une étude de R. Turpin en France, lorsque les femmes reçoivent des expositions aux rayons X dans la région pelvienne pour des affections abdominales, des mutations létales récessives sont induites dans le chromosome X présent dans l'ovule. Une telle femme produit plus de femelles et très peu de mâles dans la descendance.

Si le parent mâle est exposé aux rayons X et que des mutations létales dominantes sont induites sur son chromosome X, il y aura plus de garçons dans la descendance et peu de femelles. En effet, le chromosome X unique est transmis aux filles, entraînant leur mort.

La dystrophie musculaire (de type Duchène) est due à un gène récessif lié à l'X qui montre un phénotype visible plusieurs années après la naissance. Les garçons porteurs de ce gène sont normaux pendant environ 10 ans, après quoi il y a échec du contrôle musculaire et décès.

Iv. Mortels conditionnels:

Parfois, un organisme vit normalement dans un ensemble de conditions, mais lorsque certains changements sont introduits dans son environnement, il en résulte une létalité. L'un des premiers mortels conditionnels connus a été reconnu par Dobzhansky chez Drosophila pseudoobscura.

Les mouches vivent normalement à une température de 16,5°C, mais à 25,5°C les mouches meurent. De même, chez la guêpe Bracon hebetor, le gène mutant qui produit des reins-yeux à des températures plus basses exprime la létalité à une température de 30°C.

Un certain nombre de létaux conditionnels ont été décrits chez Drosophila melanogaster par Suzuki en 1970. Il a indiqué que certaines souches mutantes devenaient létales lorsqu'elles étaient exposées à des températures élevées uniquement pendant les derniers stades larvaires. C'est ce qu'on appelle l'étage sensible à la température.

Si les larves sont maintenues à basse température pendant le stade spécifique de sensibilité à la température, les mouches nées peuvent vivre normalement même à des températures élevées tout au long de leur cycle de vie.

Peut-être un produit génique spécifique - une enzyme ou une protéine est altérée, provoquant la mort si les larves sont exposées à une température élevée pendant la période critique. En fait, dans cette perspective, les létaux conditionnels sont largement étudiés dans les micro-organismes pour l'analyse de gènes, d'enzymes et de protéines.

Chez la volaille, il existe un gène récessif qui provoque la rupture des plumes. Les poulets homozygotes pour ce gène deviennent dépourvus de plumes mais peuvent vivre normalement s'ils sont maintenus dans un environnement relativement chaud. Mais si la température tombe en dessous de l'optimum, les poulets meurent à cause du manque d'isolation fourni par les plumes normales.

Les létaux conditionnels ont été bien étudiés dans certains organismes haploïdes tels que les levures, Neurospora et autres. Il est facile d'étudier les gènes létaux dans les organismes haploïdes car la présence d'un seul allèle entraîne la létalité.

Le type sauvage Neurospora est capable de croître sur un milieu déficient en acide aminé arginine car il produit toutes les enzymes nécessaires à la synthèse de l'arginine à partir du sucre et de l'ammoniac.

Mais une souche mutante de Neurospora ne pourra pas pousser sur le même milieu. Une souche de levure qui pousse normalement sur un milieu de glucose peut montrer des effets mortels si elle est cultivée sur un milieu contenant du galactose. Le gène mutant agit donc comme un létal conditionnel.

V. Actes mortels précoces et tardifs:

Le stade le plus précoce auquel les gènes létaux peuvent agir est évident d'après les études sur les mutations dans les gamètes. Les gamètes normaux sont plus viables et ont de meilleures chances d'effectuer la fécondation et de produire des zygotes. Les gènes mortels sont finalement perdus avec la mort des gamètes non fécondés. De tels gènes sont appelés létaux gamétiques.

Le phénomène par lequel une certaine classe de gamètes est spécifiquement inhibée de participer à la fécondation a été appelé pulsion méiotique par Sandler et Novitski. Il existe un gène appelé distorsion de ségrégation (SD) présent sur le deuxième chromosome de la drosophile. L'allèle dominant de ce gène ne permet pas aux gamètes de participer à la fécondation.

Ainsi, seuls les gamètes portant l'allèle récessif (sd) sont capables de féconder les œufs et de produire des zygotes viables. Étant donné que cela entraîne également une distorsion des rapports mendéliens typiques, le nom de distorsion de ségrégation a été donné à ce gène.

Il existe des gènes létaux qui agissent après la formation de zygotes entraînant la mort embryonnaire. Chez des animaux de laboratoire comme la souris, il est possible de déterminer cet effet létal en sacrifiant des femelles fécondées et en analysant les embryons morts.

Si toutefois la mort survient très tôt dans le développement embryonnaire, cette technique n'aboutit pas car l'observation réelle des embryons avortés n'est pas possible. Il existe un gène qui exerce un effet destructeur en empêchant le clivage normal du zygote. Un tel gène est appelé un létal zygotique.

Chez les êtres humains, le gène décrit pour provoquer des adhérences dans les poumons exprime la létalité peu après la naissance lorsque les poumons du nouveau-né ne fonctionnent pas normalement. Chez les plantes, la plupart des gènes létaux sont connus pour agir pendant ou après la germination des graines.

Parmi les gènes létaux à action tardive, certains exemples clairs peuvent être cités dans les maladies humaines. Les gènes responsables de la dystrophie musculaire (type Duchene) et de la maladie de Tay Sachs provoquent la mort avant ou dans la deuxième décennie de la vie, avant le début de la reproduction. La chorée de Huntington, en revanche, est mortelle lorsque la personne est d'âge moyen et que le gène a peut-être déjà été transmis aux générations futures.

Taper # 6. Gènes mobiles:

Il existe des gènes ou des segments d'ADN qui peuvent s'incorporer et fonctionner à plusieurs endroits du génome. Le facteur F peut s'intégrer à des sites spécifiques du génome d'E. coli. Des études moléculaires ont montré que l'élément F se compose de trois blocs fonctionnels différents de gènes.

Une région contient les gènes nécessaires au transfert de l'élément F par conjugaison d'une bactérie à une autre. Une deuxième région contrôle la réplication autonome de F. La troisième région contient un certain nombre de séquences d'insertion (IS) différentes. L'intégration du facteur F est réalisée par une recombinaison entre l'une des séquences IS sur le facteur F et une séquence IS sur le chromosome hôte.

Les séquences IS sont elles-mêmes des segments d'ADN mobiles qui peuvent être insérés en un grand nombre de sites dans différents chromosomes. Il existe un certain nombre de séquences IS connues dont 3, IS1, IS2 et IS3 ont été étudiées en détail. Celles-ci varient en taille de 700 à 1400 paires de bases.

Lorsqu'une séquence IS est insérée dans un gène, elle rompt la continuité de la séquence du gène et peut ou non inhiber l'expression du gène. Les séquences IS exercent également un certain effet sur les gènes adjacents.

Le plus souvent, les gènes adjacents sont parfois inactivés, cependant, un gène auparavant silencieux pourrait devenir activé. Les séquences IS apparaissent également comme des points chauds (emplacements vulnérables) pour les délétions, elles sont également impliquées dans un certain nombre de phénomènes de recombinaison.

Un autre groupe de segments d'ADN mobiles, dont beaucoup portent des gènes de résistance aux médicaments, sont appelés transposons. Ils ont probablement été découverts pour la première fois dans les plantes en tant qu'éléments de contrôle dans le maïs, mais ont été clairement démontrés d'abord dans les bactéries. En 1974, Hedges et Jacob ont découvert que lorsqu'un gène de résistance aux antibiotiques comme la pénicilline et l'ampicilline était transféré d'un plasmide à un autre, cela entraînait une augmentation de la taille du plasmide receveur.

La longueur d'un transposon typique est de plusieurs kilobases, quelques-uns sont beaucoup plus longs. Une grande partie de la résistance aux antibiotiques répandue parmi les bactéries est due à la propagation de transposons qui contiennent un ou plusieurs gènes de résistance aux antibiotiques. Lorsqu'un transposon se mobilise et s'insère dans un plasmide conjugatif, il peut être largement diffusé parmi différents hôtes bactériens au moyen de la conjugaison.

Certains transposons ont des structures composites avec une résistance aux antibiotiques prises en sandwich entre les séquences d'insertion. Les transposons sont généralement désignés par l'abréviation Tn suivie d'un numéro en italique, par exemple Tn5. Lorsqu'il est nécessaire d'inclure le nom du gène qu'il porte dans sa désignation, il devient Tn5 (néo-r, str-r) pour refléter la présence de gènes de résistance à la néomycine et à la streptomycine.


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